Introdução: A imunização de coelhos saudáveis com colágeno do tipo V (COLV) reproduz as principais manifestações da esclerose sistêmica (ES), incluindo fibrose, vasculopatia e produção de autoanticorpos específicos da doença. Estudos preliminares mostraram que, tanto na derme de animais imunizados com COLV (COLV-IM), como na derme de pacientes com ES, observa-se deposição aumentada de COLV anômalo, mas não se sabe qual a relevância clínica deste achado. O remodelamento da matriz extracelular é precoce nos animais COLV-IM, ocorrendo já no sétimo dia após a imunização, o que sugere que o COLV esteja relacionado com a injúria endotelial, evento primário envolvido na patogênese da ES. Desta forma, os objetivos do presente estudo foram avaliar a expressão de COLV na derme de controles saudáveis e de pacientes com ES e sua correlação com espessamento cutâneo, atividade e duração da doença; assim como pesquisar uma possível associação entre a deposição deste colágeno na derme com a expressão de marcadores de apoptose e de ativação endotelial em pacientes e no modelo animal induzido pela imunização com COLV. Pacientes e Métodos: Biópsias de pele de pacientes com ES (N=18, 6 com doença precoce e 12 com doença tardia) e de controles (N=10) pareados por idade e sexo, assim como biópsias de pele de coelhos imunizados com COLV + adjuvante de Freund (COV-IM, N=6) ou adjuvante de Freund (N=6) foram avaliadas. Nos pacientes com ES, o espessamento cutâneo foi avaliado por meio do escore de Rodnan Modificado (MRSS) e a atividade da doença foi calculada pelo índice de atividade de Valentini. Para realizar a quantificação por histomorfometria, o COLV na derme foi identificado por imunofluorescência. Caspase-3, endotelina-1, CTGF, TGF e VEGF nas células endoteliais dérmicas foram marcados por imunohistoquímica. Nos pacientes e nos controles, o COLV proveniente da cultura de fibroblastos dérmicos foi quantificado por PCR RT em tempo real e caracterizado por eletroforese, imunoblotting e reconstrução tridimensional, por meio da microscopia confocal. Resultados: O depósito de COLV foi maior na derme de pacientes com doença precoce, quando comparados aos controles e aos pacientes com doença tardia. A atividade e a duração da ES estiveram associadas com o depósito de COLV. A expressão de RNA mensageiro das cadeias COLV1 COLV2 foi aumentada em relação aos controles e a reconstrução tridimensional confirmou a presença de fibras anômalas de COLV. Observou-se maior expressão de caspase-3, endotelina-1, CTGF, TGF e VEGF nas células endoteliais dos pacientes com ES, quando comparados aos controles. Houve correlação positiva entre o depósito de COLV e a expressão de caspase-3, endotelina-1 e CTGF. Ao comparar-se os coelhos COLV-IM com os controles, observou-se aumento significativo da expressão de COLV aos 7 dias e de endotelina-1 aos 210 dias após a imunização. Embora de maneira não significativa, verificou-se maior expressão de caspase-3, CTGF e VEGF nos animais COLV-IM e, quando os animais foram comparados ao longo do tempo, percebeu-se maior expressão de COLV no sétimo dia após a imunização na derme dos animais COLV-IM, diminuindo no trigésimo dia e voltando a subir aos 75 dias e aos 210 dias. A caspase-3 e a endotelina-1 comportaram-se de maneira semelhante. Conclusão: Estes resultados sugerem que o COLV possa agir como um possível gatilho envolvido na patogênese da ES, agindo como um indutor de ativação e de apoptose endotelial, que por sua vez poderia resultar em maior expressão de COLV, perpetuando o processo de remodelamento observado na pele dos pacientes com ES / Introduction: The immunization of healthy rabbits with type V collagen (COLV) reproduces the main characteristics of systemic sclerosis (SSc), such as fibrosis, vasculopathy and specific auto-antibodies. Preliminary studies demonstrated that both COLV-immunized rabbits (COLV-IM) and SSc patients exhibit increased expression of abnormal COLV in the dermis, but the clinical relevance of this finding is unknown. The remodeling of the extracellular matrix is an early event in COLV-IM rabbits that can be detected by the seventh day after immunization; this observation suggests that COLV is involved in endothelial injury, one of the first manifestations of the disease. Thus, the objectives of this study were to evaluate COLV expression in the dermis of healthy controls and SSc patients and to determine the correlation of this expression with skin thickness, disease activity and duration and search for a possible association between this collagen with apoptosis and activation of endothelial cells markers in patients and in animal model induced by immunization with COLV. Patients and Methods: Skin biopsies from 18 patients (6 early-stage and 12 late-stage) and 10 healthy controls as well as skin biopsies from rabbits immunized with COLV (COLV-IM) and Freund adjuvant (N=6) or Freund adjuvant alone (N=6) were evaluated. Skin thickening assessment was performed with the Modified Rodnan Skin Score (MRSS), and activity was calculated using the Valentini Disease Activity Index. To perform quantification by histomorphometry, COLV was identified by immunofluorescence, and caspase-3, endothelin-1, CTGF, TGF and VEGF in dermal endothelial cells were labeled by immunohistochemistry. In SSc patients and healthy controls, COLV from dermal fibroblast culture was quantified by real-time RT-PCR and characterized by electrophoresis, immunoblotting and tridimensional reconstruction by confocal microscopy. Results: COLV deposition was increased in the dermis of the patients with early disease compared with the healthy controls and the patients with late disease. SSc activity and disease duration were associated with dermal COLV deposition. COLV1 and COLV2 mRNA expression levels were higher in SSc, and a tridimensional reconstruction of SSc dermal heterotypic fibers confirmed the presence of abnormal COLV. The dermal endothelial cell expression of caspase-3, endothelin-1, CTGF, TGF and VEGF was higher in the SSc patients than in the controls. There was a positive correlation between COLV deposition and caspase-3, endothelin-1 and CTGF expression. When the COLV-IM rabbits were compared with the controls, there was a significant increase in the expression of COLV 7 days after the immunization and a significant increase in the expression of endothelin-1 210 days after the immunization. The expression of caspase-3, CTGF and VEGF was higher in the COLV-IM animals than in the control rabbits, although not significantly, and when the rabbits were compared over time, the expression of COLV was higher in the dermis of the COLV-IM animals 7 days after immunization, decreasing at 30 days and increasing again at 75 and 210 days. Caspase-3 and endothelin-1 exhibited similar behavior. Conclusion: these results suggest that COLV can be a possible trigger involved in the pathogenesis of SSc, acting as an inducer of endothelial apoptosis and activation that could result in higher expression of COLV, perpetuating the remodeling process observed in SSc skin
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-07122012-154623 |
| Date | 30 October 2012 |
| Creators | Martin, Patricia |
| Contributors | Yoshinari, Natalino Hajime |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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