Ce projet vise à étudier, par une approche pluridisciplinaire, l'influence des la cristallisation des protéines membranaires (PM) en prenant pour protéine modèle le complexe photosynthétique RC-LH1-pufX de Rhodobacter blasticus. Des cristaux de ce complexe avaient été obtenus en présence de dodécyl-!-maltoside (DDM) et avaient diffractés à 8 Å de résolution. L'objectif final est de pouvoir améliorer, de façon rationnelle, la qualité des cristaux du complexe RC-LH1-pufX grâce à une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu. Dans un premier temps, trois tensioactifs dérivés du DDM ont été conçus et synthétisés. L'intérêt est d'augmenter la rigidité et le caractère lipophobe des parties hydrophobes des tensioactifs par rapport au DDM, pour les rendre moins déstabilisants envers la protéine: soit par l'incorporation d'un groupement bicyclohexyle (PCC-maltoside), soit par l'ajout d'un segment fluoré de longueur modulable (F4H5- et F2H9-maltoside). Nous avons inclus également le F8TAC, tensioactif fluoré utilisé depuis une vingtaine d'années pour le maintien en solution des PM, et les "tripodes", amphiphiles faciaux dont la géométrie particulière n'avaient jamais été testée. Nous avons ensuite réalisé la caractérisation physico-chimique, en solution, de ces tensioactifs et du DDM en terme de CMC (concentration micellaire critique), nombre d'agrégation, taille (par diffusion de la lumière dynamique, DLS), facteur de forme (par diffusion des rayons X aux petits angles, SAXS) et facteur de structure (par mesure du second coefficient du viriel, indicateur du potentiel des tensioactifs à initier la cristallisation)afin de déterminer les caractéristiques importantes au maintien en solution et à la cristallisation des PM. Le PCC-malt présentant le même comportement que le DDM,nous l'avons sélectionné pour réaliser une étude en présence de la protéine.Après avoir mis au point une méthode de dosage des tensioactifs par HPTLC (HighPerformance Thin Layer Chromatography) et identifier les lipides présents dans les de Rhodobacter blasticus, nous avons pu quantifier les quantités de lipides et de tensioactifs associés à la protéine en présence de DDM et de PCC-malt.Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des essais de cristallisation du complexe RC-LH1-pufX en présence des tensioactifs sélectionnés pour faire le lien entre les conditions de cristallisation et l'étude physico-chimique des micelles en solution.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-01017895 |
| Date | 28 June 2013 |
| Creators | Barret, Laurie-Anne |
| Publisher | Université d'Avignon |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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