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Previous issue date: 2017-08-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / American Cutaneous Leishmaniasis (LTA) is caused by protozoa of the genus Leishmania
and it attacks the skin and/or mucous membranes. It is an endemic zoonosis in Brazil being
notified in all the Regions. There is a relation between the species of parasite and the clinical
manifestations, contributing to the diagnostic complexity, which up to the present, did not
exist species-specific diagnosis. In the present work, the proposal was to standardize the
analysis of the PCR/RFLP products to the ITS and G6PD genes in polyacrylamide gel. In
order to standardize PCR/RFLP analysis on the ITS and G6PD genes, DNA from the
reference Leishmania spp. Sample was used and 5%, 6%, 7% 8% and 10% polyacrylamide
were tested. The protocol design considered the size of the amplicons generated by the PCR /
RFLP, correlating the concentration of the polyacrylamide. To standardize the electrophoresis
time the migration of the dyes used in the DNA sample buffer was monitored. To validate the
technique, we selected 521 samples from Tocantins patients fixed on slides and 43 samples of parasite isolates stored in Leishbank. The samples from the patients from Tocantins were
analyzed by PCR/RFLP to the kDNA and were selected to those positive for the validation.
The concentration of the matrix for analysis of the PCR and RFLP products to the ITS gene
was standardized in 6% and 8%, respectively, and distinguished the species L. (L.)
amazonensis, but the species L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis and L. (V.) lainsoni were
not distinguished among themselves, occurring the same between L. (V.) naiffi and L. (V.)
shawi. The concentration of the matrix for analysis of the PCR products to the G6PD gene
was standardized in 6% and distinguished L. (V.) braziliensis from the others. The validation
of the polyacrylamide gel analysis of the PCR products to the ITS target from samples of
patients fixed in slides was not performed, since of the 256 samples analyzed only 4
amplified. The validation of the analysis of the products of the PCR to the G6PD target in
polyacrylamide gel from 48 samples fixed in slides characterized 81% as L. (V.) braziliensis
and, characterized 63% of the isolates of parasites as L. (V.) braziliensis. The PCR/RFLP
analyzes performed to discriminate Leishmania spp. are complementary and thus contribute to the species-specific diagnosis of LTA. / A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é causada por protozoários do gênero Leishmania e acomete pele e/ou mucosas. É uma zoonose endêmica no Brasil sendo notificada em todas as Regiões. Há uma relação entre a espécie de parasito e as manifestações clínicas, contribuindo à complexidade diagnóstica, que até o presente, não existi o diagnóstico espécie-específico. No presente trabalho, a proposta foi padronizar a análise dos produtos da PCR/RFLP aos genes ITS e G6PD em gel de poliacrilamida. Para padronizar as análises dos produtos da PCR/RFLP aos genes ITS e G6PD, foram utilizadas DNA da amostra de
Leishmania spp., de referência, sendo testada a poliacrilamida na concentração de 5%, 6%, 7% 8% e 10%. O delineamento do protocolo considerou o tamanho dos amplicons gerados pela PCR/RFLP, correlacionando-o a concentração da poliacrilamida. Para padronizar o tempo da eletroforese foi monitorada a migração dos corantes usados no tampão da amostra de DNA. Para validar a técnica, foram selecionadas 521 amostras de pacientes tocantinenses fixadas em lâminas e 43 amostras de isolados de parasitos armazenados no Leishbank. As amostras dos pacientes tocantinenses foram analisadas pela PCR/RFLP ao kDNA e foram
selecionadas àquelas positivas para a validação. A concentração da matriz para analise dos
produtos da PCR e RFLP ao gene ITS ficou padronizada respectivamente em 6% e 8% e distinguiu a espécie L.(L.) amazonensis, porém as espécies L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) lainsoni não foram distinguidas entre si, ocorrendo o mesmo entre L. (V.) naiffi e L. (V.) shawi. A concentração da matriz para analise dos produtos da PCR ao gene G6PD ficou padronizada em 6% e distinguiu L. (V.) braziliensis das demais. A validação da análise em gel de poliacrilamida dos produtos da PCR ao alvo ITS a partir de amostras de pacientes fixadas em lâminas não ser realizada, pois das 256 amostras analisadas somente 4 amplificaram. A validação da análise dos produtos da PCR ao alvo G6PD em gel de poliacrilamida a partir de 48 amostras fixadas em lâminas caracterizou 81% como L. (V.) braziliensis e, caracterizou 63% dos isolados de parasitos como L. (V.) braziliensis. As análises pela PCR/RFLP realizadas para discriminar Leishmania spp. se complementam e, assim, contribuem para o diagnóstico espécie-específico da LTA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/7789 |
| Date | 30 August 2017 |
| Creators | Marques, Cálita Pollyanna |
| Contributors | Dorta, Miriam Leandro, Dorta, Miriam Leandro, Soares, Joanna Darc A. Herzog, Gomes, Rodrigo Saars |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro (IPTSP), UFG, Brasil, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública - IPTSP (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -5087190859350688984, 600, 600, 600, 600, -7769011444564556288, -4544576747271574306, -961409807440757778 |
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