Tesis por compendio / [ES] Uno de los principales objetivos de los programas de mejora genética de mandarinos es
generar nuevas variedades que no produzcan semillas ni induzcan la formación de semillas
en otras variedades por polinización cruzada, como es el caso de los híbridos triploides. La
manipulación del nivel de ploidía es una estrategia fundamental para la obtención de
híbridos triploides de mandarino sin semillas, que se pueden obtener a partir de
hibridaciones entre dos genotipos diploides, como consecuencia de la formación de
gametos no reducidos diploides, o mediante hibridaciones entre parentales diploides y
tetraploides.
En cítricos, la citometría de flujo se ha empleado para determinar el tamaño del genoma y
para determinar el nivel de ploidía de plantas regeneradas mediante técnicas de cultivo in
vitro e hibridaciones sexuales. Sin embargo, no se ha aplicado hasta el momento para el
análisis del nivel de ploidía de granos de polen maduros de genotipos diploides y euploides,
debido a la inexistencia de una metodología apropiada de extracción de núcleos. Por otro
lado, Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) es una metodología que permite, a partir
de poblaciones o subpoblaciones de núcleos de granos de polen, su aislamiento y
clasificación según su nivel de ploidía para su posterior análisis genético con marcadores
moleculares. No obstante, los análisis genéticos con marcadores moleculares se encuentran
limitados por la escasa cantidad de ADN que poseen los núcleos individualizados. Una
opción para solventar este problema es el uso de kits de Whole Genome Amplification
(WGA) que permiten generar mayor cantidad de ADN a partir del contenido de un solo
núcleo. La utilización conjunta de estas dos metodologías nunca se ha aplicado en cítricos y
su implementación permitiría generar nuevo conocimiento sobre su biología reproductiva
y su aplicación en los programas de mejora genética.
Las hibridaciones sexuales 2x X 4x y 4x X 2x son dos estrategias que permiten obtener
elevadas poblaciones de híbridos triploides. Las estructuras genéticas de estos híbridos
dependen en gran medida de los modelos de segregación cromosómica de los parentales
tetraploides, ya que influyen en la transmisión de heterocigosidad parental al gameto
diploide. Existen dos modelos extremos de segregación de plantas tetraploides, disómico y
tetrasómico, aunque también se han descrito modelos de segregación intermedia. En este
sentido, es clave realizar estudios con marcadores moleculares que permitan determinar
los modelos de segregación de los parentales tetraploides utilizados en los programas de
mejora genética de mandarino para optimizar y seleccionar las estrategias más eficientes
para la obtención de híbridos triploides con determinadas características.
En esta tesis, se ha utilizado por primera vez la citometría de flujo para determinar el nivel
de ploidía de poblaciones de granos de polen de diferentes especies diploides, triploides y
tetraploides de cítricos, demostrando que los granos de polen maduros son binucleados.
Los granos de polen de genotipos diploides mostraron dos picos perfectamente definidos
con diferentes intensidades de fluorescencia, correspondiendo el primer pico a la población de núcleos vegetativos y el segundo, a los núcleos generativos. Únicamente se han
identificado dos excepciones con picos adicionales en sus histogramas; el tangor `CSO´ y la
lima `Mexicana´. El tangor `CSO´ mostró un pico adicional de fluorescencia equivalente a la
suma de los valores fluorescencia de los núcleos vegetativos y generativos, lo que sugiere
que los núcleos permanecen unidos después de su aislamiento de los granos de polen
mediante el método de ruptura y aislamiento; y corroborado posteriormente mediante
marcadores moleculares, ya que las tres poblaciones de núcleos presentan el mismo origen
genético. Sin embargo, en la lima `Mexicana´ se han identificado por primera vez en cítricos
gametos no reducidos de polen mediante citometría de flujo. Las poblaciones de granos de
polen de genotipos triploides no evidenciaron picos claros y definidos en los histogramas
obtenidos-, mientras que los genotipos tetraploides revelaron dos poblaciones de núcleos,
una de núcleos vegetativos y la otra de núcleos generativos, con el doble de intensidad de
fluorescencia que sus núcleos homólogos en los genotipos diploides.
Una vez puesta punto una metodología para determinar el nivel de ploidía de los núcleos
de granos de polen, utilizando la técnica FACS, se aislaron individualmente los núcleos de
las poblaciones identificadas con el objetivo de analizar el origen y la estructura genética de
los núcleos de los granos de polen de genotipos diploides y tetraploides e identificar los
mecanismos implicados en la formación de gametos no reducidos de lima `Mexicana´,
mediante la amplificación del genoma de cada núcleo utilizando un kit de WGA y su
posterior análisis con marcadores moleculares de tipo Simple Sequence Repeat (SSR) y
Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Inicialmente se aislaron núcleos de las tres
poblaciones identificadas en el histograma del tangor `CSO´ y se demostró la presencia de
un solo alelo, confirmando que corresponden a núcleos de granos de polen reducidos
(normales). Estos resultados son de gran importancia para una correcta interpretación de
los histogramas, lo que nos permite afirmar que la presencia de un segundo (o tercer) pico
en las poblaciones de granos de polen no corresponde con la presencia de granos de polen
no reducidos.
El uso combinado de FACS y WGA se mostró como una metodología válida y adecuada para
la individualización y amplificación genómica de núcleos haploides de granos de polen de
genotipos diploides, permitiendo su posterior genotipado con marcadores SSR y SNP.
Posteriormente, esta metodología se utilizó tentativamente para identificar el mecanismo
implicado en la formación de gametos no reducidos de polen de lima `Mexicana´ y para
estudiar el modo de segregación cromosómica de las plantas tetraploides. Para ello, y como
control, se aislaron y amplificaron núcleos de hojas de genotipos diploides que se analizaron
con diferentes marcadores heterocigotos. Los resultados obtenidos a partir de los núcleos
diploides de hoja evidenciaron una amplificación desbalanceada hacia uno de los dos alelos
y por lo tanto no amplificando los alelos correspondientes en la proporción esperada (1:1).
Estos resultados indican que esta metodología no es adecuada para la realización de
estudios genéticos con núcleos no haploides.
Con la puesta a punto de la metodología combinada para individualizar y amplificar núcleos
haploides para su posterior análisis con múltiples marcadores moleculares, se estudiaron
por primera vez eventos de recombinación y distorsiones de la segregación (SD) en núcleos
de granos de polen haploides. El análisis de los eventos de recombinación se realizó en el
cromosoma 1 del limón `Eureka´, revelando la presencia de hasta cinco eventos en un brazo
y cuatro en el otro brazo, con un promedio 1,97 puntos de recombinación por gameto.
Asimismo, cinco muestras mostraron ausencia de eventos de recombinación para los
marcadores moleculares utilizados. La SD se analizó en una población de núcleos de granos
de polen individualizados del tangor `CSO´ y una población de plantas (`RTSO´) que se
obtuvo a partir del cruzamiento entre el tangor `RTO´ como parental femenino y el tangor
`CSO´ como parental masculino. La SD obtenida en los núcleos de granos de polen del tangor
`CSO´ fue ligeramente menor (13.8%) respecto a la observada en la población de plantas
`RTSO´ (20.7%). Ambas poblaciones mostraron SD sincronizada en el grupo de ligamiento
(GL) 2, mientras que el GL 7 solo mostró una SD en la población de plantas `RTSO´. Se
distinguieron mecanismos de selección gametofítica masculina en la población de núcleos
de granos de polen, mientras que en la población de plantas se observaron mecanismos de
selección gametofítica y/o selección zigótica. Estos resultados demuestran que esta
metodología es eficiente para realizar estudios genéticos con un gran número de
marcadores moleculares sin la necesidad de generar poblaciones. Además, podría permitir
la realización de proyectos de secuenciación en especies altamente heterocigóticas como
los cítricos evitando la obtención de haplotipos a través de técnicas de cultivo in vitro.
La obtención de dos poblaciones de híbridos triploides generadas con el mandarino
`Moncada´ tetraploide en hibridaciones 2x x 4x y 4x x 2x nos ha permitido estudiar los
modelos de segregación cromosómica a nivel masculino y femenino de un mismo genotipo.
Como parental femenino, presentó un modelo de segregación tetrasómica completa en
siete de los nueve GLs (GL1, GL2, GL3, GL5, GL6, GL7, y GL9). Sin embargo, en el GL8 se
observó un modelo de herencia intermedia con tendencia hacia la tetrasomía, mientras que
el GL4 mostró una clara herencia intermedia. Como parental masculino, siete de los GL se
ajustaron a un modelo de segregación tetrasómica, excepto en los GL 5 y 6 que presentaron
modelos de segregación intermedios. Estas variaciones en el modo de segregación a nivel
de GL según la dirección de las hibridaciones tienen importantes implicaciones en los
programas de mejora genética. Dependiendo en qué GL se encuentre un gen que controle
un carácter de interés, la regulación genética del carácter y la dirección del cruzamiento, la
segregación obtenida en la descendencia será diferente.
Además, el mandarino `Moncada´ 4x presentó valores significativos de DR. Como parental
femenino se observaron valores significativos en cinco GLs (GL2, GL3, GL4, GL7 y GL9) y
como parental masculino en seis GLs (GL2, GL3, GL4, GL5 GL6 y GL7). La producción de
valores más elevados de homocigosidad podría ser útil para los programas de mejora
genética de mandarino dirigidos a la obtención de híbridos triploides debido al potencial
efecto de “limpieza” que puede tener la DR al revelar alelos nocivos o deletéreos para la
selección y aumentar las configuraciones alélicas raras pero favorables que pueden
detectarse mediante marcadores moleculares. El conocimiento generado en esta tesis doctoral a sobre el análisis del nivel de ploidía e
individualización de núcleos de granos de polen de genotipos diploides, triploides y
tetraploides de cítricos mediante FACS y posterior amplificación genómica para su
genotipado con marcadores SSR y SNP, así como el conocimiento de los modelos de
segregación cromosómica del mandarino `Moncada´ 4x permitirá un desarrollo más
eficiente de los programas de mejora genética de cítricos con el objetivo de obtener nuevas
variedades de elite sin semillas para el mercado de consumo en fresco. De hecho, los
resultados obtenidos se están aplicando actualmente, y suponen un punto de partida para
realizar nuevos trabajos de investigación. / [CA] Un dels principals objectius dels programes de millora genètica de mandariners és generar
noves varietats que no produïsquen llavors ni induïsquen la formació de llavors en altres
varietats per pol·linització creuada, com és el cas dels híbrids triploides. La manipulació del
nivell de ploidía és una estratègia fonamental per a l'obtenció d'híbrids triploides de
mandariner sense llavors, que es poden obtindre a partir d'hibridacions entre dos genotips
diploides, com a conseqüència de la formació de gàmetes no reduïts diploides, o mitjançant
hibridacions entre parentals diploides i tetraploides.
En cítrics, la citometria de flux s'ha emprat per a determinar la grandària del genoma i per
a determinar el nivell de ploidía de plantes regenerades mitjançant tècniques de cultiu in
vitro e hibridacions sexuals. No obstant això, no s'ha aplicat fins al moment per a l'anàlisi
del nivell de ploidía de grans de pol·len madurs de genotips diploides i euploides, a causa
de la inexistència d'una metodologia apropiada d'extracció de nuclis. D'altra banda,
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) és una metodologia que permet, a partir de
poblacions o subpoblacions de nuclis de grans de pol·len, el seu aïllament i classificació
segons el seu nivell de ploidía per a la seua posterior anàlisi genètica amb marcadors
moleculars. No obstant això, les anàlisis genètiques amb marcadors moleculars es troben
limitats per l'escassa quantitat d'ADN que posseeixen els nuclis individualitzats. Una opció
per a solucionar aquest problema és l'ús de kits de Whole Genome Amplification (WGA) que
permeten generar major quantitat d'ADN a partir del contingut d'un sol nucli. La utilització
conjunta d'aquestes dues metodologies mai s'ha aplicat en cítrics i la seua implementació
permetria generar nou coneixement sobre la seua biologia reproductiva i la seua aplicació
en els programes de millora genètica.
Les hibridacions sexuals 2x X 4x i 4x X 2x són dues estratègies que permeten obtindre
elevades poblacions d'híbrids triploides. Les estructures genètiques d'aquests híbrids
depenen en gran manera dels models de segregació cromosòmica dels parentals
tetraploides, ja que influeixen en la transmissió de l´heterocigositat parental al gàmeta
diploide. Existeixen dos models extrems de segregació de plantes tetraploides, disómic i
tetrasómic, encara que també s'han descrit models de segregació intermèdia. En aquest
sentit, és clau realitzar estudis amb marcadors moleculars que permeten determinar els
models de segregació dels parentals tetraploides utilitzats en els programes de millora
genètica de mandariner per a optimitzar i seleccionar les estratègies més eficients per a
l'obtenció d'híbrids triploides amb determinades característiques.
En aquesta tesi, s'ha utilitzat per primera vegada la citometria de flux per a determinar el
nivell de ploidía de poblacions de grans de pol·len de diferents espècies diploides, triploides
i tetraploides de cítrics, demostrant que els grans de pol·len madurs són binucleat. Els grans
de pol·len de genotips diploides van mostrar dos pics perfectament definits amb diferents
intensitats de fluorescència, corresponent el primer pic a la població de nuclis vegetatius i
el segon, als nuclis generatius. Únicament s'han identificat dues excepcions amb pics
addicionals en els seus histogrames; el tangor `CSO´ i la llima `Mexicana´. El tangor `CSO´ va
mostrar un pic addicional de fluorescència equivalent a la suma dels valors de fluorescència dels nuclis vegetatius i generatius, la qual cosa suggereix que els nuclis romanen units
després del seu aïllament dels grans de pol·len mitjançant el mètode de ruptura i aïllament;
i corroborat posteriorment mitjançant marcadors moleculars, ja que les tres poblacions de
nuclis presenten el mateix origen genètic. No obstant això, en la llima `Mexicana´ s'han
identificat per primera vegada en cítrics gàmetes no reduïts de pol·len mitjançant citometria
de flux. Les poblacions de grans de pol·len de genotips triploides no van evidenciar pics clars
i definits en els histogrames obtinguts, mentre que els genotips tetraploides van revelar
dues poblacions de nuclis, una de nuclis vegetatius i l'altra de nuclis generatius, amb el doble
d'intensitat de fluorescència que els seus nuclis homòlegs en els genotips diploides.
Una vegada posada punt una metodologia per a determinar el nivell de ploidía dels nuclis
de grans de pol·len, utilitzant la tècnica FACS, es van aïllar individualment els nuclis de les
poblacions identificades amb l'objectiu d'analitzar l'origen i l'estructura genètica dels nuclis
dels grans de pol·len de genotips diploides i tetraploides i identificar els mecanismes
implicats en la formació de gàmetes no reduïts de llima `Mexicana´, mitjançant
l'amplificació del genoma de cada nucli utilitzant un kit de WGA i la seua posterior anàlisi
amb marcadors moleculars de tipus Simple Sequence Repeat (SSR) i Single Nucleotide
Polymorphism (SNP). Inicialment es van aïllar nuclis de les tres poblacions identificades en
l'histograma del tangor `CSO´ i es va demostrar la presència d'un sol al·lel, confirmant que
corresponen a nuclis de grans de pol·len reduïts (normals). Aquests resultats són de gran
importància per a una correcta interpretació dels histogrames, la qual cosa ens permet
afirmar que la presència d'un segon (o tercer) pic en les poblacions de grans de pol·len no
correspon amb la presència de grans de pol·len no reduïts.
L'ús combinat de FACS i WGA es va mostrar com una metodologia vàlida i adequada per a
la individualització i amplificació genòmica de nuclis haploides de grans de pol·len de
genotips diploides, permetent el seu posterior genotipat amb marcadors SSR i SNP.
Posteriorment, aquesta metodologia es va utilitzar temptativament per a identificar el
mecanisme implicat en la formació de gàmetes no reduïts de pol·len de llima `Mexicana´ i
per a estudiar la manera de segregació cromosòmica de les plantes tetraploides. Per a això,
i com a control, es van aïllar i van amplificar nuclis de fulles de genotips diploides que es van
analitzar amb diferents marcadors heterozigots. Els resultats obtinguts a partir dels nuclis
diploides de fulla van evidenciar una amplificació desbalanceada cap a un dels dos al·lels i
per tant no amplificant els al·lels corresponents en la proporció esperada (1:1). Aquests
resultats indiquen que aquesta metodologia no és adequada per a la realització d'estudis
genètics amb nuclis no haploides.
Amb la posada a punt de la metodologia combinada per a individualitzar i amplificar nuclis
haploides per a la seua posterior anàlisi amb múltiples marcadors moleculars, es van
estudiar per primera vegada esdeveniments de recombinació i distorsions de la segregació
(SD) en nuclis de grans de pol·len haploides. L'anàlisi dels esdeveniments de recombinació
es va realitzar en el cromosoma 1 de la llima `Eureka´, revelant la presència de fins a cinc
esdeveniments en un braç i quatre en l'altre braç, amb una mitjana 1,97 punts de
recombinació per gàmeta. Així mateix, cinc mostres van mostrar absència d'esdeveniments
de recombinació per als marcadors moleculars utilitzats. L'SD es va analitzar en una població de nuclis de grans de pol·len individualitzats del tangor `CSO´ i una població de plantes
(`RTSO´) que es va obtindre a partir del creuament entre el tangor `RTO´ com a parental
femení i el tangor `CSO´ com a parental masculí. L'SD obtinguda en els nuclis de grans de
pol·len del tangor `CSO´ va ser lleugerament menor (13.8%) respecte a l'observada en la
població de plantes `RTSO´ (20.7%). Totes dues poblacions van mostrar SD sincronitzada en
el grup de lligament (GL) 2, mentre que el GL 7 només va mostrar una SD en la població de
plantes `RTSO´. Es van distingir mecanismes de selecció gametofítica masculina en la
població de nuclis de grans de pol·len, mentre que en la població de plantes es van observar
mecanismes de selecció gametofítica i/o selecció zigótica. Aquests resultats demostren que
aquesta metodologia és eficient per a realitzar estudis genètics amb un gran nombre de
marcadors moleculars sense la necessitat de generar poblacions. A més, podria permetre la
realització de projectes de seqüenciació en espècies altament heterocigóticas com els cítrics
evitant l'obtenció de haplotipos a través de tècniques de cultiu in vitro.
L'obtenció de dues poblacions d'híbrids triploides generades amb el mandariner `Moncada´
tetraploide en hibridacions 2x X 4x i 4x X 2x ens ha permés estudiar els models de segregació
cromosòmica a nivell masculí i femení d'un mateix genotip. Com a parental femení, va
presentar un model de segregació tetrasómica completa en set dels nou GLs (GL1, GL2, GL3,
GL5, GL6, GL7, i GL9). No obstant això, en el GL8 es va observar un model d'herència
intermèdia amb tendència cap a la tetrasomía, mentre que el GL4 va mostrar una clara
herència intermèdia. Com a parental masculí, set dels GL es van ajustar a un model de
segregació tetrasómica, excepte en els GL 5 i 6 que van presentar models de segregació
intermedis. Aquestes variacions en la manera de segregació a nivell de GL segons la direcció
de les hibridacions tenen importants implicacions en els programes de millora genètica.
Depenent en quin GL es trobe un gen que controle un caràcter d'interés, la regulació
genètica del caràcter i la direcció del creuament, la segregació obtinguda en la descendència
serà diferent.
A més, el mandariner `Moncada´ 4x va presentar valors significatius de DR. Com a parental
femení es van observar valors significatius en cinc GLs (GL2, GL3, GL4, GL7 i GL9) i com a
parental masculí en sis GLs (GL2, GL3, GL4, GL5 GL6 i GL7). La producció de valors més
elevats de homocigositat podria ser útil per als programes de millora genètica de
mandariner dirigits a l'obtenció d'híbrids triploides a causa del potencial efecte de “neteja”
que pot tindre la DR en revelar al·lels nocius o deleteris per a la selecció i augmentar les
configuracions al·lèliques estranyes però favorables que poden detectar-se mitjançant
marcadors moleculars.
El coneixement generat en aquesta tesi doctoral sobre l'anàlisi del nivell de ploidía i
individualització de nuclis de grans de pol·len de genotips diploides, triploides i tetraploides
de cítrics mitjançant FACS i posterior amplificació genòmica per al seu genotipat amb
marcadors SSR i SNP, així com el coneixement dels models de segregació cromosòmica del
mandariner `Moncada´ 4x permetrà un desenvolupament més eficient dels programes de
millora genètica de cítrics amb l'objectiu d'obtindre noves varietats d'elit sense llavors per
al mercat de consum en fresc. De fet, els resultats obtinguts s'estan aplicant actualment, i
suposen un punt de partida per a realitzar nous treballs de recerca. / [EN] One of the main objectives of mandarin breeding programs is to generate new varieties that
neither produce seeds nor induce seed formation in other varieties by crossed pollination,
as with triploid hybrids. Ploidy manipulation is a fundamental strategy to obtain mandarin
triploid hybrids without seeds, which can be achieved by hybridisations between two
diploid genotypes as a result of non-reduced diploid gamete formation, or between diploid
and tetraploid parentals.
In citrus, flow cytometry has been employed to determine not only genome size, but also
the ploidy level of regenerated plants by in vitro culture techniques and sexual
hybridisations. Nevertheless, flow cytometry has not yet been applied to analyse the ploidy
level of mature pollen grains of diploid and euploid genotypes because no suitable nuclei
extraction methodology exists. Moreover, the Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
methodology isolates and classifies populations or pollen grain nuclei subpopulations
according to their ploidy level to then submit them to genetic analyses with molecular
markers. Nonetheless, genetic analyses with molecular markers are limited due to the small
amount of DNA that individual nuclei possess. One option to overcome this problem is to
use Whole Genome Amplification (WGA) kits that can obtain more DNA from the content
of a single nucleus. The joint use of both these methodologies has never been applied to
citrus, and its implementation will generate new knowledge about their reproductive
biology and application in genetic improvement programs.
2x X 4x and 4x X 2x sexual hybridisations are two strategies that allow to recover large
populations of triploid hybrids. To a great extent, the genetic structures of these hybrids
depend on the chromosome segregation models of tetraploid parentals as they influence
the parental heterozygosity transmission to diploid gametes. Two extreme tetraploid plant
segregation models exist, disomic and tetrasomic, and intermediate segregation models
have also been described. Therefore, it is key to conduct studies with molecular markers to
determine the segregation models of the tetraploid parents employed in mandarin
breeding programs to optimise and select the most efficient strategies to obtain triploid
hybrids with certain characteristics.
In this thesis, flow cytometry has been used for the first time to determine the ploidy level
of pollen grain populations from different diploid, triploid and tetraploid citrus species to
demonstrate that mature pollen grains are binucleate. The pollen grains of diploid
genotypes show two perfectly defined peaks with different fluorescence intensities: the
first peak corresponds to the vegetative nuclei population and the second to generative
nuclei. Only two exceptions have been identified with additional peaks in their histograms;
`CSO´ tangor and `Mexican´ lime. `CSO´ tangor shows another equivalent fluorescence peak
to the sum of the fluorescence values of vegetative and generative nuclei, which suggests
that nuclei continue to bind after being isolated from pollen grains via the rupture and
isolation method. This was later corroborated by molecular markers because the three
nuclei populations are of the same genetic origin. Nonetheless, non-reduced pollen gametes were identified in citrus for the first time in `Mexican´ lime by flow cytometry. The
pollen grain populations of triploid genotypes evidenced no clear well-defined peaks in the
obtained histograms, whereas two nuclei populations were revealed with tetraploid
genotypes, one vegetative nuclei population and another generative nuclei population, with
2-fold higher fluorescence intensity than their homologous nuclei in the diploid genotypes.
After setting up the methodology to determine the ploidy level of pollen grain nuclei by
FACS, the nuclei of the identified populations were individually isolated to analyse the origin
and genetic structure of the pollen grain nuclei of both the diploid and tetraploid genotypes,
and to identity the mechanisms involved in non-reduced `Mexican´ lime gamete formation
by amplifying the genome of each nucleus with a WGA kit to then be analysed by Simple
Sequence Repeat- (SSR) and Single Nucleotide Polymorphism- (SNP) molecular markers.
Initially, the nuclei of the three populations identified on the `CSO´ tangor histogram were
isolated, and the presence of a single allele was demonstrated, which confirmed that they
corresponded to (normal) reduced pollen grain nuclei. These results are most important to
correctly interpret histograms and enable us to state that the presence of a second (or third)
peak in pollen grain populations does not correspond to the presence of non-reduced pollen
grains.
The combined use of FACS and WGA is an adequate methodology for the individualisation
and whole genome amplification of haploid pollen grain nuclei of diploid genotypes because
it allows subsequent genotyping with SSR and SNP markers. Later this methodology was
used to tentatively identify the mechanism involved in the formation of non-reduced
`Mexican´ lime pollen gametes, and to study the segregation pattern of tetraploid plants.
To this end, and as a control, the nuclei of leaves from diploid genotypes were isolated and
amplified, which were analysed with different heterozygote markers. The results obtained
from diploid leaf nuclei evidenced an unbalanced amplification towards one of the two
alleles, thus the corresponding alleles were not amplified in the expected proportion (1:1).
These results indicate that this methodology is not suitable for conducting genetic studies
with non-haploid nuclei.
After setting up the combined methodology to individualise and amplify haploid nuclei to
then analyse them with many molecular markers, recombination events and segregation
distortions (SDs) were studied for the first time in haploid pollen grain nuclei. The analysis
of recombination events was carried out in chromosome 1 of `Eureka´ lemon, which
revealed the presence of up to five events on one arm and four on the other, with an
average of 1.97 recombination points per gamete. Five samples showed that recombination
events were absent for the employed molecular markers. The SD was analysed in a
population of pollen grains that were individualised from `CSO´ tangor and a plant
population (`RTSO´) obtained by a cross between `RTO´ tangor as female parent and `CSO´
tangor as male parent. The SD obtained from the pollen grain nuclei population of `CSO´
tangor was slightly lower (13.8%) than that observed in the `RTSO´ plant population (20.7%).
Both populations showed a synchronised SD in the linkage groups 2 (LG2), whereas LG7 only
displayed one SD in the `RTSO´ plant population. Gametophytic selection mechanisms were
observed in the pollen grain nuclei population, while gametophytic selection and/or zygotic selection mechanisms were noted in the plant population. These results reveal that this
methodology is efficient for conducting genetic studies using a large number of molecular
markers without having to recover progenies. It could also allow sequencing projects to be
undertaken in highly heterozygotic species like citrus to avoid obtaining haplotypes by in
vitro culture techniques.
The recovery of two different triploid hybrid populations generated with the tetraploid
`Moncada´ mandarin in 2x X 4x and 4x X 2x sexual hybridisations enabled us to study
chromosomal segregation models of the same genotype acting as male or female parent.
As a female parent, it presented a complete tetrasomic segregation model in seven of the
nine GLs (GL1, GL2, GL3, GL5, GL6, GL7 and GL9). However, an intermediate inheritance
model was observed in GL8 with a tendency towards tetrasomy, while GL4 displayed clear
intermediate inheritance. As a male parent, seven GLs matched a tetrasomic segregation
model, save in GL5 and GL6, which presented intermediate segregation models. These
variations in GL segregation according to the direction of hybridisations have major
implications for genetic breeding programs. Depending on which GL a gene is found in,
which controls not only a character of interest, but also the genetic regulation of the
character and the direction of the cross, the segregation obtained in the progenies will
differ.
Moreover, the tetraploid `Moncada´ mandarin displayed important double reduction (DR)
values. Significant values were also observed as female parent in five GLs (GL2, GL3, GL4,
GL7 and GL9) and in six GLs (GL2, GL3, GL4, GL5 GL6 and GL7) as male parent. The
production of higher levels of homozygosity could be useful in triploid mandarin breeding
for the potential cleaning effect that DR can have by revealing deleterious alleles to
selection. DR also could increase the accumulation of rare but favorable allelic
configurations through selection with molecular markers.
Knowledge acquired in this doctoral thesis on the ploidy level analysis and individualisation
of pollen grain nuclei of diploid, triploid and tetraploid citrus genotypes by FACS, followed
by WGA and genotyping with SSR and SNP markers, as well as knowledge about the
segregation patterns of tetraploid `Moncada´ mandarin, will allow citrus breeding programs
to be more efficiently run with the objective to recover new elite seedless varieties for the
fresh-fruit market. In fact, the obtained results are presently being applied and act as a
starting point to conduct new research works. / Garavello, MF. (2020). Análisis del nivel de ploidía y estructura genética de gametos de mandarino [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149567 / Compendio
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/149567 |
| Date | 02 September 2020 |
| Creators | Garavello, Miguel Fernando |
| Contributors | Aleza Gil, Pablo, Cuenca Ibáñez, José, Universitat Politècnica de València. Departamento de Biotecnología - Departament de Biotecnologia |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish, English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0062 seconds