Abstract
About one-third of mammalian proteins are secreted proteins and membrane proteins. Most of these proteins contain disulfide bonds in their native state, covalent links formed between the thiol groups of cysteine residues. In many proteins, disulfide bonds play an essential role in folding, stabilizing structure and the function of the protein. Therefore, understanding the pathways of disulfide bond formation is crucial for a wide range of medical processes and therapies. Disulfide bond formation is catalyzed by the Protein Disulfide Isomerase (PDI) family. To date the mechanisms of the PDIs in disulfide bond formation and pathways for disulfide bond formation have not been fully characterized.
Here the structure of the substrate binding <b>b’x</b> domain of human PDI was determined. The structure shows that the<b> b'</b> domain has a typical thioredoxin fold and that the <b>x</b> region can interact with the substrate binding site of the <b>b'</b> domain. Specifically, the <b>x</b> region of PDI can adopt alternative conformations during the functional cycle of PDI action and that these are linked to the ability of PDI to interact with folding substrates.
In addition, this study showed that two human proteins, GPx7 and GPx8 are involved in disulfide bond formation. The addition of GPx7 or GPx8 to a folding protein along with PDI and peroxide allows the efficient oxidative refolding of a reduced denatured substrate protein.
Finally, this thesis includes the development of a system for the efficient production of disulfide bond containing proteins in the cytoplasm of E. coli. It showed that the introduction of Erv1p, a sulfhydryl oxidase and FAD-dependent catalyst of disulfide bond, allows the formation of native disulfide bonds in the cytoplasm of E. coli even without the disruption of genes involved in disulfide bond reduction. Introduction of Erv1p and a disulfide isomerase, e.g. PDI, allows the efficient formation of natively folded eukaryotic proteins with multiple disulfide bonds in the cytoplasm of E. coli. This system is able to express high levels of complex disulfide bonded eukaryotic proteins. / Tiivistelmä
Noin kolmasosa kaikista nisäkkäiden proteiineista on solun ulkopuolelle eritettäviä proteiineja ja kalvoproteiineja. Monet näistä proteiineista sisältävät natiivissa konformaatiossaan disulfidisidoksia, jotka ovat kovalenttisia sidoksia kysteiinitähteiden tioliryhmien välillä. Useissa proteiineissa näillä disulfidisidoksilla on keskeinen rooli proteiinin laskostumisessa, kolmiulotteisen rakenteen stabiloinnissa sekä proteiinin toiminnassa. Disulfidisidosten muodostumisen taustalla olevien mekanismien tunteminen onkin tärkeää monien lääketieteellisten prosessien ja hoitomenetelmien kannalta. Disulfidisidosten muodostumista katalysoivat proteiinidisulfidi-isomeraasi (PDI) -perheeseen kuuluvat entsyymit. PDI entsyymien toimintamekanismeja ja disulfidisidosten muodostumisen reaktioreittejä ei kuitenkaan vielä tunneta tarkasti.
Tässä väitöskirjassa selvitettiin ihmisen PDI entsyymin substraattia sitovan <b>b’x</b> alayksikön rakenne. Rakenteesta voidaan todeta <b>b’</b> alayksikön laskostuminen tyypilliseen tioredoksiini muotoon sekä <b>x</b> alueen interaktio <b>b’</b> alayksikön substraattia sitovan kohdan kanssa. PDI entsyymin katalysoiman reaktioketjun aikana <b>x</b> alayksikkö voi muuttaa konformaatiotaan mahdollistaen PDI entsyymin interaktion laskostuvien substraattiproteiinien kanssa.
Tässä tutkimuksessa osoitettiin myös kahden ihmisen proteiinin, GPx7 ja GPx8 osallistuminen disulfidisidosten muodostumista katalysoiviin reaktioihin. GPx7 ja GPx8 entsyymien lisäys laskostumisreaktioon yhdessä PDI:n ja vetyperoksidin kanssa mahdollistaa pelkistetyn, denaturoidun substraattiproteiinin tehokkaan, hapettaviin reaktioihin perustuvan uudelleenlaskostumisen natiiviin muotoonsa.
Osana tätä väitöstutkimusta kehitettiin menetelmä, joka mahdollistaa disulfideja sisältävien proteiinien tehokkaan tuoton E.colin solulimassa. Menetelmässä sulfhydryylioksidaasina ja FAD:sta riippuvana disulfidisidosten muodostumisen katalysaattorina toimiva Erv1p mahdollistaa disulfidisidosten muodostumisen E.colin solulimassa myös ilman solun pelkistävien reaktioreittien geneettistä poistamista. Erv1p yhdessä disulfidi-isomeraasin, kuten PDI, kanssa mahdollistaa oikein laskostuneiden, useita disulfidisidoksia sisältävien eukaryoottisten proteiinien tehokkaan tuotannon E.colin solulimassa. Menetelmällä pystytään tuottamaan suuria määriä monimutkaisia disulfidisidoksellisia proteiineja.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:oulo.fi/oai:oulu.fi:isbn978-952-62-0725-4 |
| Date | 27 January 2015 |
| Creators | Nguyen, V. D. (Van Dat) |
| Contributors | Ruddock, L. (Lloyd) |
| Publisher | Oulun yliopisto |
| Source Sets | University of Oulu |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, © University of Oulu, 2015 |
| Relation | info:eu-repo/semantics/altIdentifier/pissn/0355-3221, info:eu-repo/semantics/altIdentifier/eissn/1796-2234 |
Page generated in 0.003 seconds