Em procariotos, a principal forma de reprodução é a divisão binária, que permite à célula-mãe dar origem a duas outras células-filhas, com conteúdo genético idêntico ao da progenitora. Em Bacillus subtilis este processo acontece graças ao divisomo, um complexo formado por aproximadamente dezesseis proteínas, que leva à constrição da membrana e da parede, formando o septo de divisão. A montagem do divisomo é coordenada por FtsZ, um homólogo de tubulina, que polimeriza na região central da bactéria e serve de arcabouço para a montagem do divisomo. Partindo de um levantamento detalhado da distribuição dos genes envolvidos em divisão em genomas completos de procariotos detectamos que divIVA, um gene de divisão já bem caracterizado, apresentava um gene parálogo em B. subtilis, conhecido como ypsB. Para determinarmos se YpsB seria um novo componente do divisomo foi realizada uma caracterização citológica e funcional desta proteína. Utilizamos microscopia de fluorescência e fusões de YpsB a GFP para determinar a localização subcelular de YpsB. Estes experimentos revelaram que YpsB está presente no divisomo, apresentando um padrão de localização semelhante mas não idêntico ao de DivIVA. Medindo-se a taxa de co-localização entre o anel Z e YpsB ficou demonstrado que estas proteínas co-localizam em aproximadamente 50%, sugerindo que YpsB é recrutada depois que o anel Z é montado. Para determinar quando YpsB chega ao divisomo, usamos mutantes termo-sensíveis das proteínas de divisão que revelaram a dependência de YpsB pelo sub complexo DivIB-DivIC-FtsL-FtsW-PBP2B. Já na ausência de DivIVA, YpsB continua associado ao divisomo, indicando que não depende do seu parálogo para localizar. Além disso, análises de deleções de YpsB mostraram que a porção N-terminal da proteína é a mais importante para o seu recrutamento ao divisomo. Para determinarmos o papel de YpsB durante a divisão foi construído um mutante com deleção completa do gene. DivIVA é uma proteína responsável por localizar o sistema Min nos pólos da bactéria e assim contribui para a precisão espacial da divisão. Apesar de serem parálogos, a função de YpsB, no entanto, parece ser diferente da de DivIVA. Análise do mutante ypsB- mostrou que na sua ausência, o divisomo é montado e o seu posicionamento tanto em fase vegetativa como em esporulação não são afetados. Como a ausência de YpsB não afeta perceptivelmente a divisão, combinamos a mutação em ypsB com mutações em outros genes envolvidos em divisão. A análise destes duplos mutantes revelou que a ausência simultânea de YpsB e FtsA produz exacerbada lise celular e letalidade. Com base neste fenótipo e em evidências evolutivas, sugerimos que YpsB esteja envolvida na regulação da síntese de peptideoglicano do septo. Mais especificamente, YpsB seria responsável por modular a atividade de PBP1, uma enzima necessária para a síntese de peptideoglicano septal. / In prokaryotes, the main form of reproduction is binary fission, which allows the mother-cell to give origin the two daughter-cells, with identical genetic material. In Bacillus subtilis, this process is performed by the divisome, a complex formed for approximately sixteen proteins that leads to the constriction of the membrane and the wall, creating the division septum. The assembly of the divisome is coordinated by FtsZ, a homolog of tubulin, that polymerizes in the central region of the bacteria and serves as the base for the assembly of the divisome. From a detailed survey of the distribution of the genes involved in division in complete genomes of prokaryotes, we detected that divIVA, a well characterized division gene, showed a paralog in B. subtilis, known as YpsB. To determine if YpsB would be a new component of the divisome, a cytological and functional characterization of this protein was carried out. We used fluorescence microscopy and fusion of YpsB to GFP to determine the subcellular localization of YpsB. These experiments displayed that YpsB is present in the divisome, with similar but not identical localization as DivIVA. Measuring co-localization between the Z ring and YpsB demonstrated that this happened in approximately 50% of the cells, suggesting that YpsB go to the divisome after the Z ring is formed. To determine when YpsB goes to the divisome, we used temperature-sensitive mutants of the division proteins. This showed that YpsB depends on the DivIB-DivIC-FtsL-FtsW-PBP2B sub-complex to associate with the divisome. In the absence of DivIVA, YpsB is still present in the divisome, indicating that it does not depend on its paralog to localize. Moreover, deletion analyses of YpsB showed that the N-terminal portion of the protein is the most important for its recruitment to the divisome. To determine the role of YpsB during division, we constructed a ypsB- mutant. DivIVA is the protein responsible for localization of the Min system in polar regions of B. subtilis and, thus, contributes for the spatial precision of division. Our results showed that the function of YpsB must be different from that of DivIVA, since analysis of the ypsB- mutant showed that in the absence this protein the divisome is assembled and septum position in vegetatively growing or sporulating cells is not affected. Since the absence of YpsB does not affect division, we combined the ypsB- mutant with mutants involved in division. Analysis of these double mutants showed that the simultaneous absence of YpsB and FtsA caused cellular lysis and lethality. Based on this phenotype and evolutionary evidences, we suggest that YpsB is involved in the regulation of peptidoglycan synthesis in the septum. More specifically, YpsB would be responsible for modulating the activity of PBP1, a necessary enzyme for septum peptidoglycan synthesis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26082009-141509 |
| Date | 31 July 2009 |
| Creators | Tavares, José Roberto |
| Contributors | Gueiros Filho, Frederico José |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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