As serino-proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE) constituem uma família de proteases secretadas pelo sistema de secreção do tipo V, cujos genes foram estudados em Escherichia coli intestinal e extra-intestinal. Sat é uma SPATE citotóxica de 107 kDa, cujo gene foi identificado pela primeira vez em UPEC isolada da urina de um paciente com pielonefrite. A maioria dos estudos envolvendo Sat foram realizados em células renais e da bexiga, embora seu gene seja encontrado em DAEC, EAEC e, mais recentemente, em amostras bacterianas isoladas de septicemia neonatal e meningite. Os objetivos deste trabalho foram: i) purificar Sat; ii) determinar a ação da Sat purificada em diferentes tipos celulares e iii) caracterizar o papel de Sat na infecção in vitro por EAEC. Desta foram, a presença de Sat nos sobrenadantes do cultivo das cepas EAEC CV323 e DEC/Sat, isoladas de diarreia, foi confirmada por LC-MS/MS. Sat foi purificada da cultura de DEC/Sat+ e utilizada para a obtenção de anticorpos anti-Sat em coelho. O efeito citotóxico de Sat purificada foi investigado em células derivadas do endotélio (HUVEC) e do sistema urinário (Y1, LLC-PK1 e HEK-293) e gastrointestinal (Caco-2). Os parâmetros citotóxicos analisados foram: o descolamento celular e alterações na morfologia, permeabilidade e metabolismo mitocondrial das células. Para investigar o papel de Sat na infecção por EAEC, células Y-1 foram infectadas com EAEC CV323 e DEC/Sat+ na presença ou ausência de PMSF (inibidor de serino-protease) e anticorpos anti-Sat. Os parâmetros de citotoxicidade analisados nas culturas infectadas foram descolamento celular e alteração na morfologia. Os resultados demonstraram que: i) Sat é secretada por EAEC CV323 e DEC/Sat+ e, em ambas as cepas, há duas mutações em resíduos de aminoácidos que não interferiram na atividade enzimática; ii) as células do endotélio são mais sensíveis à Sat do que as células derivadas do trato urinário, sendo a linhagem gastrointestinal a mais resistente; iii) Sat secretada por EAEC CV323 durante a infecção induziu intenso dano celular, o qual, em presença de anticorpos anti-Sat e PMSF foi reduzido em cerca de 80 a 90%, respectivamente. Este é o primeiro trabalho que demonstra a expressão de Sat pela EAEC e a ação da toxina em células endoteliais sugerindo que o papel de Sat possa ser mais amplo na patogenia do que o proposto até o momento. / The serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATEs) constitute a family of proteases secreted by the type V secretion system whose genes have been studied in intestinal and extra intestinal Escherichia coli. Sat is a 107 kDa cytotoxic SPATE and its gene was first identified in UPEC isolated from the urine of a patient with pyelonephritis. Most studies involving Sat were performed in renal and bladder cells, although the gene encoding Sat is encountered in other strains of E. coli such as DAEC, EAEC and more recently, in bacterial samples isolated from neonatal septicemia and meningitis. The objectives of this work were: i) purify Sat; ii) to determine the action of Sat in different types of cells and iii) to characterize in vitro the role of Sat in EAEC infection. Accordingly, the presence of Sat in the culture supernatant of EAEC CV323 and DEC/Sat+ derived from diarrhea was confirmed by LCMS/MS. Sat was purified from the culture of DEC/Sat+ and utilized to produce rabbit antibodies anti-Sat. The cytotoxic effect of Sat was investigated in cells derived from the endothelium (HUVEC) and the urinary (Y1, LLC-PK1, HEK-293) and gastrointestinal (Caco-2) systems. The cytotoxic parameters analyzed were cellular detachment and alterations in the morphology, permeability and mitochondrial metabolism of the cells. To investigate the role of Sat in EAEC infection, Y-1 cells were incubated with EAEC CV323 and DEC/Sat+ in the presence or absence of PMSF (a serine protease inhibitor) and rabbit antibodies anti-Sat. The parameters analyzed were cellular detachment and alteration in the morphology of the cells. The results demonstrated that: i) Sat is secreted by EAEC CV323 and DEC/Sat + and in both strains there are two mutations in amino acid residues that did not interfere with enzymatic activity; ii) endothelium cells are more sensitive to the Sat effect than the cells derived from urinary tract system, being the gastrointestinal cell lineage the most resistant one; iii) Sat secreted by EAEC CV323 during infection induced intense cellular damage which in the presence of anti-Sat antibodies and PMSF was reduced in about 80 to 90%, respectively. This is the first work demonstrating the expression of Sat by EAEC and the action of the toxin on endothelial cells suggesting that the role of Sat may be broader in pathogenesis than has been proposed so far.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-12122018-141016 |
| Date | 07 August 2018 |
| Creators | Vieira, Paulo Cesar Gomes |
| Contributors | Ruiz, Rita de Cássia |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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