O câncer colorretal está entre as principais neoplasias malignas sendo a quarta causa de morte por câncer no mundo e a terceira no Brasil. Mutações nos genes APC, DCC, K-RAS e TP53 foram originalmente associadas com a progressão do câncer colorretal (CCR) esporádico. Entretanto, estudos de genoma completo e exoma têm revelado outros genes relacionados com o CCR. Como consequência dessas mutações, um conjunto de genes alteram sua expressão modulando vias gênicas em cada estágio da progressão tumoral. Nesse sentido, há um grande esforço para definir assinaturas gênicas que auxiliem na classificação dos tumores quanto ao diagnóstico e prognóstico dos pacientes. Portanto, o objetivo deste projeto foi analisar a expressão gênica em escala genômica de amostras de adenoma e adenocarcinoma colorretal visando identificar novos marcadores genéticos ligados a transição adenoma-adenocarcinoma. Para isso, dez amostras pareadas de adenoma e adenocarcinoma do mesmo paciente foram submetidas à análise de expressão gênica pela técnica de microarranjos. Análises de bioinformática, revelaram uma assinatura de 689 genes diferencialmente expressos (fold-change>2, p<0.05), que permitiram a classificação genética entre o adenoma e o adenocarcinoma. Oitos genes (IL6, IL8, OSM, SFRP4, ETV4, ESM1, SIM2 e RETNLB) foram escolhidos para validação com base na sua função e valor de expressão no tecido tumoral. A análise in silico dos genes hiperexpressos realizada no programa MetaCore (análise de dados e vias gênicas) destacou diversas vias gênicas ligadas à tumorigênese, incluindo as de adesão celular e Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM), importantes na fase avaçada da progressão tumoral. O gene ETV4 foi selecionado para realização dos ensaios funcionais em virtude de seus altos níveis de expressão nas dez amostras de adenocarcinoma e participação nos mecanismos de proliferação celular e no TEM. Ensaios in vitro de siRNA para o gene ETV4 resultou na diminuição da proliferação celular e no potencial clonogênico da linhagem HT29. Adicionalmente, foram investigadas mutações nos genes APC, K-RAS e TP53, nas amostras pareadas de adenoma, adenocarcinoma, tecido normal e sangue periférico dos dez pacientes. Todos os pacientes apresentaram mutação germinativas nos três genes. No entanto, apenas os genes K-RAS (40%) e TP53 (30%) apresentaram mutações somáticas e patogênicas, exclusivamente nos adenocarcinomas. Esses resultados demonstraram que, na nossa coorte, mutações nos genes TP53 e K-RAS podem estar contribuindo para a progressão em uma parcela do câncer colorretal do tipo esporádico. Em resumo, o presente estudo aponta que o gene ETV4 pode contribuir para ativar o mecanismo de proliferação celular em adenocarcinoma colorretal. Além disso, o estudo demonstra a importância da combinação da análise de mutação com o perfil de expressão para melhor compreensão da base molecular do câncer colorretal. / Colorectal cancer is among the main malignant neoplasia, it is the fourth leading cause of death in the world and the third in Brazil. Mutations in APC, DCC, KRAS and TP53 genes have been originally associated with the progression of sporadic colorectal cancer (CRC). However genome wide and exome studies have revealed other genes related to CRC. As a consequence of these mutations, a set of genes alters their expression modulating gene pathways in every stage of tumor progression. In this regard, there is great effort to define gene signatures that help to classify tumors in relation to patients diagnosis and prognosis. Therefore, the objective of this project was to analyze gene expression in genomic scale of colorectal adenoma and adenocarcinoma samples aiming to identify new genetic markers linked to adenoma- adenocarcinoma transition. For this purpose, ten paired adenoma and adenocarcinoma samples of the same patient were subjected to gene expression analysis by microarrays technique. Bioinformatics analyses revealed a signature of 689 genes differentially expressed (fold-change>2, p<0.05), which allowed the genetic classification between adenoma and adenocarcinoma. Eight genes (IL6, IL8, OSM, SFRP4, ETV4, ESM1, SIM2 and RETNLB) were chosen for validation based on their function and expression value in tumor tissue. In silico analysis of hyperexpressed genes, done in the program MetaCore (data analysis and gene pathways), highlighted diverse gene pathways linked to tumorigenesis, including the ones of cell adhesion and Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT), important in the advanced phase of tumor progression. ETV4 gene was selected for functional assays due to its high expression levels in the ten samples of adenocarcinoma and due to its participation in cell proliferation mechanisms and in EMT. In vitro siRNA assays for ETV4 gene resulted in the decrease of cell proliferation and in the clonogenic potential of HT29 line. In addition, mutations in APC, KRAS and TP53 genes were investigated in paired samples of adenoma, adenocarcinoma, normal tissue, and peripheral blood from ten patients. All patients showed germline mutations in the three genes. However, only KRAS (40%) and TP53 (30%) genes showed somatic and pathogenic mutations, exclusively in adenocarcinomas. These results demonstrated that, in our cohort, mutations in TP53 and KRAS genes might be contributing to progression in a portion of sporadic-type colorectal cancer. In summary, the present study points out that ETV4 gene might contribute to activate cell proliferation mechanism in colorectal adenocarcinoma. Moreover, the study demonstrates the importance of combining the mutation analysis with expression profile in order to better understanding the molecular basis of colorectal cancer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18122014-095654 |
| Date | 18 November 2014 |
| Creators | Fonseca, Aline Simoneti |
| Contributors | Silva Junior, Wilson Araújo da |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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