O câncer colorretal está entre as principais neoplasias malignas sendo a quarta causa de morte por câncer no mundo e a terceira no Brasil. Mutações nos genes APC, DCC, K-RAS e TP53 foram originalmente associadas com a progressão do câncer colorretal (CCR) esporádico. Entretanto, estudos de genoma completo e exoma têm revelado outros genes relacionados com o CCR. Como consequência dessas mutações, um conjunto de genes alteram sua expressão modulando vias gênicas em cada estágio da progressão tumoral. Nesse sentido, há um grande esforço para definir assinaturas gênicas que auxiliem na classificação dos tumores quanto ao diagnóstico e prognóstico dos pacientes. Portanto, o objetivo deste projeto foi analisar a expressão gênica em escala genômica de amostras de adenoma e adenocarcinoma colorretal visando identificar novos marcadores genéticos ligados a transição adenoma-adenocarcinoma. Para isso, dez amostras pareadas de adenoma e adenocarcinoma do mesmo paciente foram submetidas à análise de expressão gênica pela técnica de microarranjos. Análises de bioinformática, revelaram uma assinatura de 689 genes diferencialmente expressos (fold-change>2, p<0.05), que permitiram a classificação genética entre o adenoma e o adenocarcinoma. Oitos genes (IL6, IL8, OSM, SFRP4, ETV4, ESM1, SIM2 e RETNLB) foram escolhidos para validação com base na sua função e valor de expressão no tecido tumoral. A análise in silico dos genes hiperexpressos realizada no programa MetaCore (análise de dados e vias gênicas) destacou diversas vias gênicas ligadas à tumorigênese, incluindo as de adesão celular e Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM), importantes na fase avaçada da progressão tumoral. O gene ETV4 foi selecionado para realização dos ensaios funcionais em virtude de seus altos níveis de expressão nas dez amostras de adenocarcinoma e participação nos mecanismos de proliferação celular e no TEM. Ensaios in vitro de siRNA para o gene ETV4 resultou na diminuição da proliferação celular e no potencial clonogênico da linhagem HT29. Adicionalmente, foram investigadas mutações nos genes APC, K-RAS e TP53, nas amostras pareadas de adenoma, adenocarcinoma, tecido normal e sangue periférico dos dez pacientes. Todos os pacientes apresentaram mutação germinativas nos três genes. No entanto, apenas os genes K-RAS (40%) e TP53 (30%) apresentaram mutações somáticas e patogênicas, exclusivamente nos adenocarcinomas. Esses resultados demonstraram que, na nossa coorte, mutações nos genes TP53 e K-RAS podem estar contribuindo para a progressão em uma parcela do câncer colorretal do tipo esporádico. Em resumo, o presente estudo aponta que o gene ETV4 pode contribuir para ativar o mecanismo de proliferação celular em adenocarcinoma colorretal. Além disso, o estudo demonstra a importância da combinação da análise de mutação com o perfil de expressão para melhor compreensão da base molecular do câncer colorretal. / Colorectal cancer is among the main malignant neoplasia, it is the fourth leading cause of death in the world and the third in Brazil. Mutations in APC, DCC, KRAS and TP53 genes have been originally associated with the progression of sporadic colorectal cancer (CRC). However genome wide and exome studies have revealed other genes related to CRC. As a consequence of these mutations, a set of genes alters their expression modulating gene pathways in every stage of tumor progression. In this regard, there is great effort to define gene signatures that help to classify tumors in relation to patients diagnosis and prognosis. Therefore, the objective of this project was to analyze gene expression in genomic scale of colorectal adenoma and adenocarcinoma samples aiming to identify new genetic markers linked to adenoma- adenocarcinoma transition. For this purpose, ten paired adenoma and adenocarcinoma samples of the same patient were subjected to gene expression analysis by microarrays technique. Bioinformatics analyses revealed a signature of 689 genes differentially expressed (fold-change>2, p<0.05), which allowed the genetic classification between adenoma and adenocarcinoma. Eight genes (IL6, IL8, OSM, SFRP4, ETV4, ESM1, SIM2 and RETNLB) were chosen for validation based on their function and expression value in tumor tissue. In silico analysis of hyperexpressed genes, done in the program MetaCore (data analysis and gene pathways), highlighted diverse gene pathways linked to tumorigenesis, including the ones of cell adhesion and Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT), important in the advanced phase of tumor progression. ETV4 gene was selected for functional assays due to its high expression levels in the ten samples of adenocarcinoma and due to its participation in cell proliferation mechanisms and in EMT. In vitro siRNA assays for ETV4 gene resulted in the decrease of cell proliferation and in the clonogenic potential of HT29 line. In addition, mutations in APC, KRAS and TP53 genes were investigated in paired samples of adenoma, adenocarcinoma, normal tissue, and peripheral blood from ten patients. All patients showed germline mutations in the three genes. However, only KRAS (40%) and TP53 (30%) genes showed somatic and pathogenic mutations, exclusively in adenocarcinomas. These results demonstrated that, in our cohort, mutations in TP53 and KRAS genes might be contributing to progression in a portion of sporadic-type colorectal cancer. In summary, the present study points out that ETV4 gene might contribute to activate cell proliferation mechanism in colorectal adenocarcinoma. Moreover, the study demonstrates the importance of combining the mutation analysis with expression profile in order to better understanding the molecular basis of colorectal cancer.

O câncer colorretal está entre as principais neoplasias malignas sendo a quarta causa de morte por câncer no mundo e a terceira no Brasil. Mutações nos genes APC, DCC, K-RAS e TP53 foram originalmente associadas com a progressão do câncer colorretal (CCR) esporádico. Entretanto, estudos de genoma completo e exoma têm revelado outros genes relacionados com o CCR. Como consequência dessas mutações, um conjunto de genes alteram sua expressão modulando vias gênicas em cada estágio da progressão tumoral. Nesse sentido, há um grande esforço para definir assinaturas gênicas que auxiliem na classificação dos tumores quanto ao diagnóstico e prognóstico dos pacientes. Portanto, o objetivo deste projeto foi analisar a expressão gênica em escala genômica de amostras de adenoma e adenocarcinoma colorretal visando identificar novos marcadores genéticos ligados a transição adenoma-adenocarcinoma. Para isso, dez amostras pareadas de adenoma e adenocarcinoma do mesmo paciente foram submetidas à análise de expressão gênica pela técnica de microarranjos. Análises de bioinformática, revelaram uma assinatura de 689 genes diferencialmente expressos (fold-change>2, p<0.05), que permitiram a classificação genética entre o adenoma e o adenocarcinoma. Oitos genes (IL6, IL8, OSM, SFRP4, ETV4, ESM1, SIM2 e RETNLB) foram escolhidos para validação com base na sua função e valor de expressão no tecido tumoral. A análise in silico dos genes hiperexpressos realizada no programa MetaCore (análise de dados e vias gênicas) destacou diversas vias gênicas ligadas à tumorigênese, incluindo as de adesão celular e Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM), importantes na fase avaçada da progressão tumoral. O gene ETV4 foi selecionado para realização dos ensaios funcionais em virtude de seus altos níveis de expressão nas dez amostras de adenocarcinoma e participação nos mecanismos de proliferação celular e no TEM. Ensaios in vitro de siRNA para o gene ETV4 resultou na diminuição da proliferação celular e no potencial clonogênico da linhagem HT29. Adicionalmente, foram investigadas mutações nos genes APC, K-RAS e TP53, nas amostras pareadas de adenoma, adenocarcinoma, tecido normal e sangue periférico dos dez pacientes. Todos os pacientes apresentaram mutação germinativas nos três genes. No entanto, apenas os genes K-RAS (40%) e TP53 (30%) apresentaram mutações somáticas e patogênicas, exclusivamente nos adenocarcinomas. Esses resultados demonstraram que, na nossa coorte, mutações nos genes TP53 e K-RAS podem estar contribuindo para a progressão em uma parcela do câncer colorretal do tipo esporádico. Em resumo, o presente estudo aponta que o gene ETV4 pode contribuir para ativar o mecanismo de proliferação celular em adenocarcinoma colorretal. Além disso, o estudo demonstra a importância da combinação da análise de mutação com o perfil de expressão para melhor compreensão da base molecular do câncer colorretal. / Colorectal cancer is among the main malignant neoplasia, it is the fourth leading cause of death in the world and the third in Brazil. Mutations in APC, DCC, KRAS and TP53 genes have been originally associated with the progression of sporadic colorectal cancer (CRC). However genome wide and exome studies have revealed other genes related to CRC. As a consequence of these mutations, a set of genes alters their expression modulating gene pathways in every stage of tumor progression. In this regard, there is great effort to define gene signatures that help to classify tumors in relation to patients diagnosis and prognosis. Therefore, the objective of this project was to analyze gene expression in genomic scale of colorectal adenoma and adenocarcinoma samples aiming to identify new genetic markers linked to adenoma- adenocarcinoma transition. For this purpose, ten paired adenoma and adenocarcinoma samples of the same patient were subjected to gene expression analysis by microarrays technique. Bioinformatics analyses revealed a signature of 689 genes differentially expressed (fold-change>2, p<0.05), which allowed the genetic classification between adenoma and adenocarcinoma. Eight genes (IL6, IL8, OSM, SFRP4, ETV4, ESM1, SIM2 and RETNLB) were chosen for validation based on their function and expression value in tumor tissue. In silico analysis of hyperexpressed genes, done in the program MetaCore (data analysis and gene pathways), highlighted diverse gene pathways linked to tumorigenesis, including the ones of cell adhesion and Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT), important in the advanced phase of tumor progression. ETV4 gene was selected for functional assays due to its high expression levels in the ten samples of adenocarcinoma and due to its participation in cell proliferation mechanisms and in EMT. In vitro siRNA assays for ETV4 gene resulted in the decrease of cell proliferation and in the clonogenic potential of HT29 line. In addition, mutations in APC, KRAS and TP53 genes were investigated in paired samples of adenoma, adenocarcinoma, normal tissue, and peripheral blood from ten patients. All patients showed germline mutations in the three genes. However, only KRAS (40%) and TP53 (30%) genes showed somatic and pathogenic mutations, exclusively in adenocarcinomas. These results demonstrated that, in our cohort, mutations in TP53 and KRAS genes might be contributing to progression in a portion of sporadic-type colorectal cancer. In summary, the present study points out that ETV4 gene might contribute to activate cell proliferation mechanism in colorectal adenocarcinoma. Moreover, the study demonstrates the importance of combining the mutation analysis with expression profile in order to better understanding the molecular basis of colorectal cancer.

Environ 30% des cancers humains ont une mutation gain de fonction dans l’oncogène RAS, menant à une prolifération cellulaire accrue et une expansion clonale. Cependant, il est bien établi qu’une hyperactivation soutenue de cette voie mène au phénotype inverse, soit la sénescence cellulaire, définie par un arrêt stable de la prolifération. Ce destin cellulaire caractérise les lésions bénignes et la progression vers une tumeur maligne est associée à son contournement. Toutefois, les mécanismes moléculaires permettant aux cellules de distinguer entre une signalisation normale et oncogénique par RAS afin de les engager vers la sénescence plutôt que la prolifération demeurent inconnus. Ainsi, l’hypothèse à la base de ces travaux est que la décision d’engagement vers la sénescence implique une reprogrammation transcriptionnelle qui précède l’établissement des phénotypes caractéristiques de la sénescence, tel le phénotype sécrétoire (SASP) (Article 1). Nous avons ainsi identifié un point de restriction (SeRP) critique pour l’engagement des cellules vers la sénescence en réponse à l’oncogène HRASG12V. Ce SeRP intègre l'intensité et la durée du stress oncogénique, tout en gardant une mémoire des stress antérieurs, en modulant l’accessibilité à la chromatine via l’induction d’un réseau auto-régulé de facteurs de transcription comprenant notamment ETV4 et RUNX1 (Article 2). Notre modèle actuel nous porte à croire que cette augmentation d’accessibilité à la chromatine impliquerait principalement une décondensation de l’hétérochromatine périnucléolaire. Ceci mènerait à l’induction du SASP et aux défauts de ribogénèse observés dans la sénescence. Nous montrons d’ailleurs via la génération d’un modèle murin transgénique que l’induction de tels défauts de ribogénèse à l’échelle systémique mène à un phénotype de vieillissement prématuré suggérant une sénescence des cellules souches (Article 3). Les cellules souches ayant des niveaux particulièrement élevés de ribogénèse et étant très sensibles à des altérations de leur niche tels que l’inflammation chronique, nous pensons que, de manière fortuite, ce modèle reproduit en quelque sorte les conséquences du SeRP. En somme, l’ensemble des travaux présentés dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régulant l’engagement vers la sénescence. À termes, ces nouvelles notions permettraient de concevoir des stratégies thérapeutiques permettant de faire pencher la balance vers la sénescence dans un contexte de cancers mutés en RAS. / Around 30% of human cancers have a gain-of-function mutation in the RAS oncogene, resulting in increased cell proliferation and clonal expansion. However, it is well established that a sustained hyperactivation of this same pathway leads instead to the opposite phenotype, namely cellular senescence, which is defined by a stable proliferation arrest. This cell fate characterizes benign lesions and progression to malignancy is associated with its bypass. However, the molecular mechanisms allowing cells to distinguish between normal and oncogenic RAS signaling in order to commit them to senescence rather than proliferation remain unknown. Thus, the hypothesis underlying the present work is that this decision to commit to senescence involves a transcriptional reprogramming that precedes the establishment of the senescence-characteristic phenotypes such as the secretory phenotype (Article 1). We have thus identified a restriction point (SeRP) critical for the commitment of cells towards senescence in response to HRASG12V oncogene. This SeRP integrates both the intensity and duration of oncogenic stress while keeping a memory of previous stresses. This integration is achieved by modulating chromatin accessibility via the induction of a self-regulated network of transcription factors including among others ETV4 and RUNX1 (Article 2). Our current model leads us to believe that this increase in chromatin accessibility during the SeRP would mainly involve decondensation of perinucleolar heterochromatin. This would lead to the induction of the pro-inflammatory secretome of senescent cells (SASP) and the ribogenesis defects observed in senescence. Besides, we show via the generation of a transgenic mouse model that the induction of such ribogenesis defects at the systemic scale leads to a premature aging phenotype suggesting stem cells senescence (Article 3). Stem cells having particularly high levels of ribogenesis and being very sensitive to alterations of their niche such as chronic inflammation, we believe that serendipitously, this model somehow reproduces the consequences of the SeRP. In short, all the work presented in this thesis allows for a better understanding of the molecular mechanisms regulating the commitment to senescence. Ultimately, these new notions would allow to design therapeutic strategies to tip the balance towards senescence in the context of RAS-mutated cancers.