Una de las características de las células bacterianas es la capacidad de adaptarse rápidamente a los frecuentes cambios en las condiciones ambientales del entorno donde se encuentran. En los procariotas la regulación de la expresión génica constituye una herramienta fundamental para dicha adaptación a las condiciones ambientales, posibilitando que tales cambios se vean reflejados en los patrones de expresión génica. La capacidad de modificar el patrón de expresión génica en función de parámetros ambientales es un aspecto crucial en la supervivencia tanto de bacterias que se encuentran en el medio ambiente externo como de bacterias patógenas localizadas en el interior de un organismo hospedador.
En este trabajo el primer objetivo fue establecer un modelo de regulación del gen hilA de Salmonella por las proteínas asociadas a cromatina H-NS y Hha, para intentar posteriormente extrapolar este modelo a los reguladores de tipo HilA de la cepa de E. coli 042. Posteriormente, nos planteamos caracterizar el fenotipo resultante de la mutación hha en la cepa de E. coli 042.
Los resultados obtenidos revelaron que el gen hilA se induce en fase estacionaria en cultivos crecidos en medio LB a 37ºC. Las proteínas asociadas a cromatina H-NS y Hha reprimen la expresión de hilA bajo un conjunto de condiciones ambientales. En condiciones de baja temperatura, es decir a 25ºC, H-NS posee los papeles mayoritarios en la represión de hilA. Bajo condiciones las cuales simularían la presencia de un hospedador, es decir 37ºC, H-NS deja de actuar y si tiene lugar la inducción de hilA en fase estacionaria. Además de los factores temperatura y osmolaridad que interfieren con la represión de hilA por H-NS se caracterizó la acción antagonista de la proteína IHF sobre la represión mediada por H-NS en el gen hilA utilizando ensayos de transcripción in vitro.
En atención a las proteínas tipo HilA encontradas en la cepa de E. coli 042, se pudo caracterizar que ambas proteínas EilA e YgeH son capaces de complementar en trans la mutación hilA en la cepa de Salmonella SV5015. La activación de proteínas efectoras por parte de las proteínas EilA e YgeH en Salmonella parece tener lugar de la misma manera que HilA, a través de la activación del gen invF. Los resultados de regulación transcripcional de los genes eilA e ygeH revelaron una represión por parte de la proteína H-NS, y los ensayos de EMSA apoyan estos resultados. Existe una regulación cruzada entre las islas de patogenicidad ETT2 y eip de la cepa 042. La proteína EilA parece poder activar la expresión de EivF en ausencia de la proteína YgeH.
El fenotipo encontrado en el mutante hha de la cepa de E. coli 042 se resume en un aumento de la agregación celular y una deficiencia en la formación de biofilms a 37ºC. El fenotipo es dependiente de temperatura, solamente se observa a 37ºC. Dados de proteómica obtenidos con la construcción AggR::3XFLAG revelaron una sobreexpresión del regulador transcripcional AggR en el mutante hha de la cepa de E. coli 042. Finalmente, la secuenciación masiva de ARN del mutante hha de la cepa de E. coli 042 apoyan estos resultados y revelaron que la transcripción del gen hha envuelve dos patrones diferentes en función de la temperatura. Mientras que a 37ºC la transcripción tiene lugar en la cadena codificante a 25ºC se produce también una importante transcripción en la cadena antisentido, lo que podría interpretarse como que, a baja temperatura se expresa menos el gen hha. / In this work our first goal was to understand and clarify the regulatory role of the nucleoid-associated proteins H-NS and Hha in the regulation of the master regulator of Salmonella pathogenicity island 1 (SPI1), the hilA gene. Due to the presence of HilA orthologous proteins of E. coli 042 strain (EilA and YgeH), we extrapolated the regulation patterns of hilA gene to eilA and ygeH genes. Subsequently, we characterized the phenotype of the hha mutant in the E. coli 042 strain.
The results obtained on hilA regulation showed a high induction in the stationary phase of growth when cells were grown in LB medium at 37ºC. The H-NS and Hha proteins repressed the hilA expression under determinate environmental conditions. At low temperature (25ºC) H-NS repressed the hilA gene and Hha enhanced the repression. At high temperature (37ºC) H-NS no longer repressed hilA and the induction of hilA gene took place. Besides temperature and osmolarity factors that interfere with the repression of H-NS in the hilA gene, we characterized an antagonist effect of IHF protein in the H-NS-mediated repression of hilA gene using in vitro transcription assays.
In relation to the HilA type proteins found in the strain of E. coli 042, YgeH and EilA, both proteins were able to complement in trans the hilA mutation in Salmonella strain SV5015. The activation of effector proteins by EilA and YgeH proteins in Salmonella seemed to work in the same way than HilA, through invF gene activation. The EMSA assays and the results of transcriptional regulation of genes and ygeH and eilA suggested a repression by H-NS. We also observed a cross-regulation pathway between pathogenicity islands eip and ETT2 in the E. coli 042 strain. EilA protein activated EivF expression in the absence of YgeH proteins.
The phenotype found in the hha mutant in the strain of E. coli 042 was both an increase in cell aggregation and a deficiency in biofilm formation. The phenotype was temperature dependent, and it was only observed at 37°C. Proteomics results of the AggR::3xFLAG construction obtained, revealed an overexpression of the transcriptional regulator AggR in the mutant strain hha. Finally, the whole transcriptome shotgun sequencing of the hha mutant of the E. coli 042 supported these findings and revealed that hha gene transcription involved two different patterns depending on the temperature. The transcriptional data suggested that at 37°C the transcription occurred in the coding strand, while at 25°C the transcription occurred in the antisense strand.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/98244 |
| Date | 30 November 2012 |
| Creators | Hüttener Queiroz, Mario |
| Contributors | Juárez Giménez, Antonio, Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 228 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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