Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), l'agent causal de bactériose vasculaire du riz (BLB), injecte des protéines de liaison à l'ADN, appelées Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) dans les cellules hôtes afin de moduler l'expression de gènes cibles. Certains TALEs agissent comme des facteurs de virulence majeurs, indispensables à la mise en place du BLB et ciblent des gènes de sensibilité du riz. Les TALEs majeurs de Xoo ciblent universellement les gènes de sensibilité de la famille SWEET. Il existe dans la nature un polymorphisme des séquences ADN des gènes SWEET reconnues par les TALEs qui confère une résistance à la maladie. L’utilisation de la technologie TALEN a permis d'introduire artificiellement ce type de mutation dans le promoteur du gène de sensibilité SWEET14 le rendant insensible aux TALEs et conférant une résistance à certaines souches de Xoo asiatiques. La caractérisation des populations de Xoo africaines montrent qu'elles sont distinctes de celles d’Asie. L’objectif du projet de thèse était de créer à l'aide des technologies d'édition des génomes des sources de résistances efficaces contre un large panel de Xoo maliennes.Dans une première partie, l'édition des boites ADN de SWEET14 ciblées par des TALEs majeurs de souches africaines a effectivement permis d'obtenir des résistances contre les souches utilisant le TALE TalF (initialement appelé Tal5) mais pas contre celles utilisant TalC. La caractérisation du répertoire de TALEs des souches maliennes par des approches fonctionnelles (sensibilité des lignées éditées, expression de SWEET14 et autres gènes cibles de TALEs) et in silico (séquençage du génome de 8 souches) à révélé une diversité fonctionnelle de ces répertoires et la présence simultanée quasi systématique de versions actives et redondantes de TalF et TalC. La caractérisation de la sensibilité de variétés de riz locales aux souches de Xoo maliennes a montré que ces dernières possèdent un large spectre de virulence et qu'à une exception près, toutes les variétés testées sont sensibles au BLB. L'édition en multiplex par la technique CRISPR/Cas9 des boites TalF et TalC a aboli l'induction de SWEET14 en réponse à une souche malienne. Cependant, les lignées correspondantes sont restées sensibles à cette souche. Dans la dernière partie, pour expliquer ce résultat, nous avons postulé l'existence d'au moins un gène de sensibilité, cible de TalC et redondant avec SWEET14. Une approche bioinformatique a permis d'identifier un locus dont plusieurs caractéristiques en faisaient un candidat intéressant. Ce locus, nommé ATAC (pour Alternative TalC Target) est composé de deux gènes, ATAC1 et ATAC2 induits de façon bidirectionnelle par TalC. Nous avons montré qu'ATAC2, qui code pour un facteur de transcription bHLH atypique potentiellement impliqué dans l’élongation cellulaire et l'immunité chez le riz, se comporte comme un locus de sensibilité lorsqu'il est induit par des TALE artificiels dans un système gain de fonction. Nous avons édité simultanément le promoteur SWEET14 et le locus ATAC. Ces éditions devraient empêcher la reconnaissance du promoteur SWEET14 et du locus ATAC par TalC et TalF afin de conférer une résistance large au BLB au Mali. / Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), the causal agent of bacterial leaf blight of rice (BLB), injects DNA binding proteins called Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) into host cells to manipulate plant genes expression. Some TALEs behave as major virulence factors essential for BLB to occur by binding directly to target DNA boxes of rice susceptibility genes and inducing their expression. Xoo major TALEs universally target susceptibility genes of the SWEET family. In nature, polymorphism in the DNA sequence of SWEET genes recognized by TALEs confers resistance to BLB. Using the TALEN technology, this type of mutations has been artificially introduced in the promoter of the SWEET14 susceptibility gene to make it TALE-unresponsive and confer resistance to some Asian Xoo. The characterizations of Malian Xoo populations show that they are distinct from the Asian ones. The PhD project aimed to create broad tailored BLB resistance against Malian Xoo using genome editing technologies.First, editing SWEET14 DNA boxes targeted by major TALEs of African strains indeed yielded resistance against strains relying on TalF (initially named Tal5) but not against those relying on TalC. The characterization of Malian strains TALE repertoires using functional (edited lines susceptibility assays, SWEET14 and other TALE target expression studies) and in silico (genome sequencing of 8 strains) approaches uncovered functional diversity in these repertoires and, the almost systematic, simultaneous presence of active and redundant versions of TalF and TalC. In susceptibility assays of local rice varieties, Malian Xoo strains exhibited a broad virulence spectrum and, with one exception, all tested varieties were susceptible to BLB. Multiplex editing of TalF and TalC target boxes with the CRISPR/Cas9 technology abolished SWEET14 induction in response to a Malian strain. However the corresponding rice lines remained susceptible to this strain. Finally, to explain these results, we postulated the existence of, at least, a TalC target susceptibility gene redundant with SWEET14. Bioinformatics analysis identified a rice locus with several features electing it as a high priority candidate. This locus named ATAC (Alternative TalC Target) is composed of two genes, ATAC1 and ATAC2, bidirectionally upregulated by TalC. We further showed that ATAC2 which is predicted to code for an atypical bHLH transcription factor potentially involved in rice cell elongation and immunity, behaves as a susceptibility gene upon artificial TALEs-mediated induction in a gain of function assay. We used the CRISPR/Cas9 system to simultaneously edit the SWEET14 promoter and the ATAC locus. These mutations should prevent the recognition of the SWEET14 promoter and the ATAC locus by TalC and TalF, compromise their transcriptional induction and ultimately provide broad BLB resistance in Mali.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2017MONTT100 |
| Date | 28 November 2017 |
| Creators | Doucoure, Hinda |
| Contributors | Montpellier, Verdier, Valérie |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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