Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung zellulärer Testsysteme bei Patienten mit Verdacht auf latente Infektion mit M. tuberculosis. Eine latente Tuberkulose kann unter Immunsuppression zu einer aktiven Tuberkulose werden. Deshalb wird bei immunsuppressiven Therapien insbesondere mit TNF-alpha-Blockern eine Chemoprävention empfohlen. Daher ist es sehr wichtig, latente Infektionen zu erkennen.
Ist ein Patient mit M. tuberculosis infiziert, reagieren seine T-Zellen auf Stimulation mit Antigenen wie ESAT-6 und CFP-10. Diese Immunantwort ist die Grundlage der modernen IFN-γ release Assays (IGRA). ESAT-6 und CFP-10 fehlen bei allen BCG-Stämmen und bei den meisten nicht-tuberkulösen Mykobakterien mit Ausnahme von M. kansasii, M. szulgai und M. marinum (Andersen et al. 2000; Behr et al, 1999; Lalvani 2003). Im Gegensatz dazu haben Personen, die mit M. tuberculosis-Komplex-Organismen infiziert sind, in der Regel T-Zellen im Blut, die diese und andere mykobakterielle Antigene erkennen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Nutzung von IGRA in der medizinischen Labordiagnostik dahingehend zu analysieren, ob es Unterschiede zwischen ELISPOT-basierten Tests und Röhrchen-Tests als Testformat gibt, inwieweit diese Tests im klinischen Alltag verlässlich sind und ob sich mit einem anderen Auswertealgorithmus eine sicherere Aussage zum Vorliegen einer latenten Tuberkulose treffen lässt.
Im Einzelnen wurden dabei drei Ansätze verfolgt:
1. In einer retrospektiven Studie wurden die Ergebnisse von 2686 Patienten ausgewertet, die im Labor des Instituts für Klinische Immunologie des Universitätsklinikums Leipzig von 2013 bis 2016 als Routineuntersuchungen erhoben wurden. Bei klinisch unplausiblen Ergebnissen wurden bei einem Teil der Patienten eine Wiederholungsuntersuchungen durchgeführt. Die analytische Sensitivität und Spezifität sowie den positiven und negativen prädiktiven Wert konnten wir nur unter der Annahme abschätzen, dass der Ausfall in der Wiederholungsuntersuchung einen Hinweis auf falsch- oder richtig-positive oder -negative Werte zulässt. Wir kommen damit zu einer Sensitivität von nur 28 %, einer Spezifität von immerhin 91 %, einem positiven prädiktiven Wert von 32 % und einem negativen prädiktiven Wert von 90 %. Damit sind 68 % der positiven Werte falsch positiv und 10 % der negativen Werte falsch negativ.
Unsere Untersuchungen zur Wiederholbarkeit der ELISPOT-Tests im eigenen Labor bestätigen, dass negative Ergebnisse meist wiederholbar sind, positive Werte jedoch skeptisch betrachtet werden müssen.
2. Seit 2012 sendet Instand e.V. zweimal jährlich Ringversuchsproben für den IGRA aus (Ringversuch 650, https://www.instand-ev.de/). Wir analysierten, wie viele Labors bei Teilnahme an der externen Qualitätssicherung (sogenannten Ringversuchen) für IGRA ein korrektes Ergebnis erzielt hatten und ob Unterschiede zwischen ELISPOT-Assay und Röhrchen-Test bestehen. Im Ringversuch waren die Ergebnisse von ELISPOT (z.B. TB-Spot, Oxford Immunotec) und Röhrchentest (Quantiferon Gold bzw. Gold-Plus, Qiagen oder Diasorin) bis auf den 2. Ringversuch 2019 vergleichbar und unterschieden sich nicht.
3. Obwohl die meisten Labore an den Ringversuchen erfolgreich teilnehmen, ist die recht häufige Anzahl vor allem falsch positiver Ergebnisse im diagnostischen Alltag problematisch. Wir haben daher in einem dritten Untersuchungsschritt die Validierungsdaten eines Labors detailliert untersucht, um ein definiertes Verfahren zur Ermittlung positiver Testergebnisse vorzuschlagen. Zwischen 2011 und 2013 erfolgte im Labor Ettlingen eine umfangreiche Qualitätssicherung des ELISPOT unter Nutzung von 70 Proben in Doppelbestimmung. Dabei wurden jeweils die Messungen für die Positiv- und die Negativkontrolle sowie die Werte nach Stimulation mit ESAT-6 und CFP-10 analysiert. Um relevante Unterschiede zwischen Negativkontrolle und der eigentlichen Messung zu bewerten, wurden die Unterschiede mit der Wiederholpräzision in Beziehung gesetzt: Die Unterschiede sollten größer sein als die daraus abgeleitete Ungenauigkeit (Impräzision) der Messungen. Daraus wurde ein Cut-off-Wert kalkuliert, der unmittelbar auf den Daten des Labors beruht. Hierzu ist die Homogenität der Standardabweichungen über alle Proben erforderlich. Sie wird durch die Wurzeltransformation aller Daten erreicht. Für die verwendeten Daten ist sie anwendbar (Altman 1991, Bland 2000). Dies bedeutete bei den untersuchten Daten, dass bei Doppelbestimmungen die Unterschiede zwischen dem Testergebnis immer um den Faktor 0,76 größer sein muss als die Negativkontrolle. Dazu sind allerdings zwei Voraussetzungen zu erfüllen:
1. die Werte müssen vor Analyse wurzeltransformiert werden.
2. benötigt werden mindestens Doppelbestimmungen.
Da keine Doppelbestimmungen vorliegen, konnte das Verfahren nicht an einem eigenen Datensatz verifiziert werden.
Wir schlussfolgern daraus zusammenfassend:
1. in der Praxis gibt es keine wesentlichen Unterschiede zwischen ELISPOT und Röhrchen-Test als Testformat, was Sensitivität und Spezifität anbelangt
2. IGRAs sind ein verlässliches Werkzeug im klinischen Alltag, insbesondere wenn es um den Ausschluss einer latenten Tuberkulose geht
3. die Auswertung von ELISPOT-Daten lässt sich über Mehrfachbestimmung und quadratwurzeltransformierte Auswertung optimieren (wobei das noch in einer Folgearbeit zu beweisen ist).:Inhalt
Abkürzungsverzeichnis 3
1 EINFÜHRUNG 5
1.1 Epidemiologie der Tuberkulose 5
1.2 Pathogenese der Tuberkulose 8
1.3 Prävention der Tuberkulose 10
1.4 Diagnostik der Tuberkulose 11
1.4.1 Radiologische Untersuchungen 12
1.4.2 Mikrobiologische Untersuchungen 12
1.4.3 Molekularbiologischer Nachweis 13
1.5 Nachweis der Immunreaktion gegenüber M. tuberculosis 14
1.5.1 Tuberkulin-Hauttest 14
1.5.2 Serologische Tests auf M. tuberculosis-Infektion 16
1.5.3 Zelluläre Labortests auf M. tuberculosis-Reaktivität 18
2 AUFGABENSTELLUNG 22
3 MATERIAL UND METHODEN 23
3.1 Patienten 23
3.2 Blutentnahme und Zellpräparation 23
3.3 ELISPOT 25
3.4 Ringversuch zur externen Qualitätssicherung 26
3.5 Retrospektive Analyse der Daten des eigenen Labors und der Ringversuchsdaten 26
3.6 Analyse der Validierungsdaten aus Ettlingen 27
4 ERGEBNISSE 29
4.1 Analyse der ELISPOT-Daten des eigenen Labors 29
4.2 Ergebnisse des Instand-Ringversuchs 33
4.3 Analyse der ELISPOT-Wiederholungsmessungen 35
5 DISKUSSION 41
6 Zusammenfassung 48
Literaturverzeichnis 52
Lebenslauf 63
Danksagung 64
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 65
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:74989 |
| Date | 28 May 2021 |
| Creators | Müller, Bert |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/updatedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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