O maior desafio para a produção de bioenergia continua sendo a precisa desconstrução da parede celular de vegetal. Tendo em vista viabilizar a produção de etanol de segunda geração (2G) em larga escala, bem como otimizar o procedimento de produção do etanol de primeira geração (1G), estudos vêm sendo desenvolvidos com foco na produção de enzimas lignocelulósicas, principalmente as de origem fúngica. Esses estudos visam o aperfeiçoamento de coquetéis enzimáticos, compostos principalmente por enzimas que atacam celulose e hemiceluloses. No entanto, sabemos que as paredes celulares vegetais possuem também pectinas e recentemente foi demonstrado que pectinases podem melhorar sensivelmente o processo de hidrólise (até 30%). Após o levantamento de dados referentes a diferentes enzimas pectinolíticas denominadas endopoligalacturonases (EPGs) já caracterizadas e catalogadas no banco de dados CAZy, foi possível verificar que aquelas produzidas por fungos filamentosos contabilizam mais de 65%. A partir disso foi realizada uma análise filogenética de todas as EPGs caracterizadas produzidas por diferentes organismos. O resultado demonstrou que enzimas dessa família produzidas por bactérias também com interesse biotecnológico são mais próximas de plantas do que dos próprios fungos. Além disso, a proporção de enzimas caracterizadas de bactérias e plantas era significativamente menor que o observado para EPGs de fungos. Isso evidenciou uma lacuna no conhecimento sobre enzimas de plantas, ainda pouco exploradas no contexto de biotecnologia e bioenergia. Este trabalho apresenta a clonagem, expressão heteróloga e caracterização da EPG de cana-de-açúcar recombinante. O principal objetivo é obter informações a respeito de uma enzima com atividade chave na degradação de parede celular, haja vista ter sido ela isolada de um processo de ataque endógeno à pectina da própria cana-de-açúcar. Como resultado, a endopoligalacturonase de Saccharum sp. foi eficientemente expressa em sistema de expressão heterólogo com Pichia pastoris X33. O clone produtor selecionado gerou os maiores valores de proteínas totais no sobrenadante de cultivo com 96 horas de indução com metanol. A partir do extrato bruto do sobrenadante coleta, os melhores valores de atividade enzimática foram obtidos quando da incubação por 22 horas a 45 C em tampão acetato de sódio pH 5,0. Sais, detergentes e quelantes atuaram como inibidores da atividade enzimática e, por outro lado, o agente redutor ditiotreitol (DTT) foi responsável pelo incremento de atividade enzimática. Por fim, os parâmetros cinéticos obtidos para a enzima caracterizada indicam a possibilidade de utilizá-la como complemento de coquetéis enzimáticos, conhecidamente pobres em pectinases. / The biggest challenge for bioenergy production remains the disassembly of the extracellular matrix of some plant species. For the large-scale production of second generation ethanol (2G), and optimizing the first generation ethanol (1G) production process, studies have been developed focusing on the production of lignocellulosic enzymes, especially those of produced by fungi. These studies aim at the improvement of enzymatic cocktails, composed mainly of enzymes that are capable of attacking cellulose and hemicelluloses. However, it is a known fact that the plant cell walls also contain pectins and it has been recently demonstrated that pectinases could significantly improve the hydrolysis process (up to 30%). After an analysis of different pectinolytic enzymes known as endopoligalacturonases (EPGs), already characterized and cataloged under the CAZy database, it was possible to verify that fungi enzymes account for more than 65% of all of the characterized EPGs. The result has shown that enzymes from this family produced by bacteria - also with biotechnological interest - are closer to plants than fungi. Besides, the proportion of characterized enzymes from bacteria and plants was significantly lower than that observed for fungal EPGs. This evidenced a gap in knowledge about plant enzymes, still little explored in the context of biotechnology and bioenergy. This work presents the cloning, heterologous expression, and characterization of recombinant sugarcane EPG. The primary objective is to obtain information about an enzyme with key activity in cell wall degradation since it has been isolated from a process of an endogenous attack on sugarcane pectin itself. As a result, the endopoligalacturonase of Saccharum sp. was efficiently expressed through the heterologous expression system with Pichia pastoris X33. The selected clone generated the highest total protein values in the culture supernatant at 96 hours of methanol induction. From the crude extract of the supernatant collected, the best enzyme activity values were obtained upon incubation for 22 hours at 45°C in pH 5.0 sodium acetate buffer. Salts, detergents, and chelators acted as inhibitors of the enzymatic activity and, on the other hand, the reducing agent dithiothreitol (DTT) was responsible for the increase of enzymatic activity. Finally, the kinetic parameters obtained for the enzyme characterized indicate that it can be used as a complement to enzymatic cocktails, which are known to be poor in pectinases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30052019-133026 |
| Date | 13 November 2018 |
| Creators | Latarullo, Mariana Brolezzi Gomes |
| Contributors | Buckeridge, Marcos Silveira, Maldonado, Gabriel Padilla |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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