Die Eph-Familie, welche die Eph-Rezeptoren und die ephrin-Liganden umfasst, repräsentiert die größte Subgruppe der Rezeptortyrosinkinasen. Sowohl die Eph-Rezeptoren als auch die ephrin-Liganden sind Membran-assoziierte Proteine, deren Interaktion einen Typ der Zellkontakt-vermittelten Kommunikation darstellt und vielfältigste zelluläre Funktionen beeinflusst. Die aktuellen Eph/ephrin-bezogenen Forschungsschwerpunkte liegen vor allem im Bereich der Entwicklungs- und Tumorbiologie, wie z.B. dem Einfluss der Eph-Familie auf Angiogenese und Axonaussprossung. Die Rolle des Eph/ephrin-Systems in der Entwicklung der Atherosklerose und bei Reparaturmechanismen wie der Reendothelialisierung ist jedoch noch weitgehend unerforscht. Die vorliegende Arbeit befasst sich anhand von in vitro Experimenten mit HUVEC und HUAEC mit dem Einfluss des Liganden ephrin-A1 und des Rezeptors EphA2 auf die endotheliale Proliferation und Migration als elementare Mechanismen der Reendothelialisierung.:INHALTSVERZEICHNIS I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX
TABELLENVERZEICHNIS XI
1 EINLEITUNG 1
1.1 Die Rolle des Endothels in der Atherosklerose 1
1.2 Die Migration von Endothelzellen 6
1.3 Die Eph-Familie 9
1.4 Potentielle Funktionen der Eph-Familie in der endothelialen Proliferation und Migration 14
1.5 Zielstellung der Arbeit 16
2 MATERIAL 17
2.1 Geräte 17
2.2 Zellkulturmaterial 18
2.3 Verwendete Kulturmedien 18
2.4 Verwendete Zelllinien und E. coli Stämme 19
2.5 Verwendete Kit-Systeme 19
2.6 Verwendete Oligonukleotide 20
2.7 Verwendete Plasmide 21
2.8 Konstruierte Plasmide 23
2.9 Chemikalien 23
2.10 Puffer, Gele, Lösungen 23
3 METHODEN 24
3.1 Zellbiologische Methoden 24
3.2 Proteinbiochemische Methoden 28
3.3 Molekularbiologische und gentechnische Methoden 32
3.4 Scratch Assay 44
3.5 Beurteilung der Zellproliferation mittels BrdU-Inkorporation 44
3.6 Wundheilungsassay 45
3.7 Migrationsassay 48
3.8 Baculovirale Talin-RFP- und Aktin-GFP-Expression 49
3.9 Datenanalyse und statistische Auswertung 49
4 ERGEBNISSE 50
4.1 Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung verschiedener Eph/ephrine in proliferierenden Endothelzellen 50
4.2 Molekularbiologische Charakterisierung von ephrin-A1, EphA2 und EphA4 unter Kontaktinhibition in HUVEC 56
4.3 Einfluss eines Zellzyklusarrests auf die Expression verschiedener ephrin-Liganden und Eph-Rezeptoren in Endothelzellen 58
4.4 Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 mittels siRNA 63
4.5 Einfluss einer siRNA-vermittelten Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 auf die Proliferation von HUVEC 65
4.6 Überexpression von ephrin-A1 mittels eines adenoviralen Vektors 67
4.7 Einfluss einer Überexpression von ephrin-A1 auf die Proliferation von HUVEC 68
4.8 Reinitiation von Proliferation und Migration in HUVEC mittels Scratch Assay 69
4.9 Einfluss der Modulation des ephrin-A1- sowie EphA2-Gehaltes auf das Wundheilungsverhalten von HUVEC 73
4.10 Charakterisierung des Migrationsverhaltens von HUVEC unter veränderter ephrin-A1-Expression mittels live cell imaging 75
4.11 Einfluss einer veränderten ephrin-A1-Expression auf den EphA2-Phosphorylierungsstatus 78
4.12 Grenzzonenverhalten von HUVEC an ephrin-A1-beschichteten Oberflächen 80
4.13 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung fokaler Adhäsionen und des Aktin-Zytoskelettes unter modulierter ephrin A1 Expression 81
5 DISKUSSION 84
5.1 Die Eph-Familie im Kontext der Reendothelialisierung 84
5.2 Einfluss des Eph/ephrin Systems auf das Proliferationsverhalten von Zellen 86
5.3 Auswirkungen einer ephrin-A1-EphA2-Wechselwirkung auf die Proliferation 90
5.4 Einfluss der Eph-Familie auf die zelluläre Migration und Wundheilung 93
5.5 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 106
6 ZUSAMMENFASSUNG 109
6.1 In deutscher Sprache 109
6.2 In englischer Sprache 111
7 LITERATURVERZEICHNIS 113
8 DANKSAGUNG 133
9 ANHANG 134
10 ERKLÄRUNGEN 138
10.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 138
10.2 Erklärung über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen der Dissertation 140 / The Eph-family represents the largest subgroup of tyrosine kinase receptors. Both the Eph-receptors and the ephrin-ligands are membrane-associated proteins whose interaction is a way of contact-dependent communication that influences a wide variety of cellular functions. In scientific research the Eph-family is known for its impact on developmental and tumour-biology, whereas the role of Eph-receptors and ephrin-ligands in atherosclerosis and repair mechanisms is still not well understood. The aim of the present study was to examine the influence of the ligand ephrin-A1 and its interaction with its receptor EphA2 on endothelial proliferation and migration by performing cellcultural experimentation using HUVEC and HUAEC.:INHALTSVERZEICHNIS I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX
TABELLENVERZEICHNIS XI
1 EINLEITUNG 1
1.1 Die Rolle des Endothels in der Atherosklerose 1
1.2 Die Migration von Endothelzellen 6
1.3 Die Eph-Familie 9
1.4 Potentielle Funktionen der Eph-Familie in der endothelialen Proliferation und Migration 14
1.5 Zielstellung der Arbeit 16
2 MATERIAL 17
2.1 Geräte 17
2.2 Zellkulturmaterial 18
2.3 Verwendete Kulturmedien 18
2.4 Verwendete Zelllinien und E. coli Stämme 19
2.5 Verwendete Kit-Systeme 19
2.6 Verwendete Oligonukleotide 20
2.7 Verwendete Plasmide 21
2.8 Konstruierte Plasmide 23
2.9 Chemikalien 23
2.10 Puffer, Gele, Lösungen 23
3 METHODEN 24
3.1 Zellbiologische Methoden 24
3.2 Proteinbiochemische Methoden 28
3.3 Molekularbiologische und gentechnische Methoden 32
3.4 Scratch Assay 44
3.5 Beurteilung der Zellproliferation mittels BrdU-Inkorporation 44
3.6 Wundheilungsassay 45
3.7 Migrationsassay 48
3.8 Baculovirale Talin-RFP- und Aktin-GFP-Expression 49
3.9 Datenanalyse und statistische Auswertung 49
4 ERGEBNISSE 50
4.1 Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung verschiedener Eph/ephrine in proliferierenden Endothelzellen 50
4.2 Molekularbiologische Charakterisierung von ephrin-A1, EphA2 und EphA4 unter Kontaktinhibition in HUVEC 56
4.3 Einfluss eines Zellzyklusarrests auf die Expression verschiedener ephrin-Liganden und Eph-Rezeptoren in Endothelzellen 58
4.4 Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 mittels siRNA 63
4.5 Einfluss einer siRNA-vermittelten Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 auf die Proliferation von HUVEC 65
4.6 Überexpression von ephrin-A1 mittels eines adenoviralen Vektors 67
4.7 Einfluss einer Überexpression von ephrin-A1 auf die Proliferation von HUVEC 68
4.8 Reinitiation von Proliferation und Migration in HUVEC mittels Scratch Assay 69
4.9 Einfluss der Modulation des ephrin-A1- sowie EphA2-Gehaltes auf das Wundheilungsverhalten von HUVEC 73
4.10 Charakterisierung des Migrationsverhaltens von HUVEC unter veränderter ephrin-A1-Expression mittels live cell imaging 75
4.11 Einfluss einer veränderten ephrin-A1-Expression auf den EphA2-Phosphorylierungsstatus 78
4.12 Grenzzonenverhalten von HUVEC an ephrin-A1-beschichteten Oberflächen 80
4.13 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung fokaler Adhäsionen und des Aktin-Zytoskelettes unter modulierter ephrin A1 Expression 81
5 DISKUSSION 84
5.1 Die Eph-Familie im Kontext der Reendothelialisierung 84
5.2 Einfluss des Eph/ephrin Systems auf das Proliferationsverhalten von Zellen 86
5.3 Auswirkungen einer ephrin-A1-EphA2-Wechselwirkung auf die Proliferation 90
5.4 Einfluss der Eph-Familie auf die zelluläre Migration und Wundheilung 93
5.5 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 106
6 ZUSAMMENFASSUNG 109
6.1 In deutscher Sprache 109
6.2 In englischer Sprache 111
7 LITERATURVERZEICHNIS 113
8 DANKSAGUNG 133
9 ANHANG 134
10 ERKLÄRUNGEN 138
10.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 138
10.2 Erklärung über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen der Dissertation 140
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:35456 |
| Date | 20 September 2019 |
| Creators | Wiedemann, Elisa |
| Contributors | Poitz, David M., Wielockx, Benjamin, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German, German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 10.1016/j.cellsig.2016.10.003 |
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