Introdução: Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção. Mucograft® (MCS-3D) é um substituto xenógeno novo que vem sendo utilizado na periodontia em técnicas de recobrimento radicular e aumento de tecido queratinizado. O objetivo do presente estudo foi avaliar morfológica e imunohistoquimicamente, se a MCS-3D é uma matriz tridimensional adequada, por meio de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de três indivíduos. Os FGH foram cultivados sobre colágeno bovino bidimensional (ColB-2D), colágeno bovino tridimensional (ColB-3D) e matriz colágena suína tridimensional (MCS-3D) por até 10 dias. Em 3, 7 e 10 dias, os seguintes parâmetros foram avaliados: número, morfologia e distribuição de FGH por fluorescência direta; viabilidade celular por MTT; proliferação celular e expressão de proteínas citoesqueléticas: actina e tubulina e proteínas da matriz extracelular não colágena: fibronectina imunofluorescência indireta. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos de Friedman para comparação intra e intergrupos para as variáveis da análise de expressão das proteínas: fibronectina, actina e tubulina. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparações intra e intergrupos, seguido do teste de Tukey para as variáveis das análises de viabidlidade, proliferação e número total de células. Resultados: A epifluorescência revelou que em 3 dias os FGH apresentavam-se aderidos em todos os grupos experimentais. FGH cultivados sobre ColB-2D exibiram forma menos alongada, ampla e achatada com maior quantidade de projeções e numerosas fibras de estresse em 3, 7 e 10 dias. Por outro lado, os FGH cultivados sobre ColB-3D e MCS-3D demonstraram, em todos os períodos experimentais, fenótipo fusiforme, alongado ou cilíndrico com menor quantidade de projeções do que observado no substrato 2D, com algumas das células cultivadas sobre MCS-3D demonstrando aspecto estrelado. O ensaio de MTT revelou viabilidade celular significantemente superior no ColB-2D e MCS-3D do que no ColB-3D (p<0,001), em todos os períodos experimentais. Em 3 dias, foi observado maior número de FGH cultivados sobre ColB-2D seguido por MCS-3D e ColB-3D respectivamente, havendo diferença estatística entre ColB-2D e MCS-3D (p<0,001) e entre ColB-2D e ColB-3D (p<0,001). No sétimo dia houve redução no número de células no ColB-2D e aumento na MCS-3D e ColB-3D, em que o número de células foi significantemente superior no ColB-2d com relação a MCS-3D (p=0,002). Ao final do período experimental, foi observado aumento no número de células em todos os grupos experimentais, sendo o número de células, mais uma vez, significantemente superior no ColB-2D do que na MCS-3D (p=0,002). Maior porcentagem de FGH no ciclo celular pode ser observado em ColB-2D seguido por ColB-3D e MCS-3D, respectivamente, em todos os períodos experimentais. Na MCS-3D praticamente não houve marcação por Ki-67 e o ColB-2D apresentou redução significativa de FGH ciclando entre o período de 3 e 10 dias (p=0,036). A expressão de proteínas não colágenas e citoesqueléticas foi similar em ambas as matrizes experimentais durante todo o estudo. Conclusão: Podemos concluir que a MCS-3D constitui uma matriz adequada para o cultivo de fibroblastos gengivais humanos, uma vez que, no interior da matriz, importantes propriedades foram verificadas, dentre as quais, morfologia, proliferação, e expressão de proteínas, semelhantes a uma matriz colágena tridimensional já consagrada na literatura. / Introduction: Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Mucograft® (PCM-3D) is a new xenogeneic substitute that has been used in periodontics in techniques such as root coverage and increasing keratinized tissue. The aim of this investigation was to verify if PCM-3D is a suitable three-dimensional matrix though its in vitro response to the culture of HGF. Methods: Human gingival fibroblasts (HGF) culture was established by the explant technique of gingival connective tissues of three healthy patients. HGF were seeded on bidimensional bovine collagen matrix (BCol-2D), three-dimensional bovine collagen matrix (BCol- 3D) and three-dimensional porcine collagen matrix (PCM-3D). HGF were grown for up to 10 days. At 3, 7 and 10 days the following parameters were assessed: HGF number, morphology and distribution by direct fluorescence; cell viability by MTT; cell proliferation and expression of proteins of the extracellular matrix non-collagenous fibronectina and cytoeskeletic - proteins actin and tubulin by indirect immunofluorescence. Quantitative data were submitted to Friedman and Kruskal- Wallis test, and the last one was followed by Tukeys test. Results: Epifluorescence revealed that at 3 days HGF grown on BCol-2D were broader, more flattened and had more cell protrusions and stress fibers in all experimental times. On the other hand, HGF seeded on BCol-3D and PCM-3D displayed a spindle-shaped, elongated, or cylindrical phenotype with fewer protrusions as well as less total cell spread area than on the 2D matrix, with some cells on PCM-3D showing stellate appearance. MTT assay showed cell viability higher in cultures grown on BCol-2D and PCM-3D than in BCol-3D (p<0,001). At 3days a greater number of cells in BCol-2D samples followed by PCM-3D and BCol-3D, respectively, was observed with statistical difference between BCol-2D and PCM-3D and between (p<0,001). At 7 days, there was a decrease in cell number grown on BCol-2D and an increase in BCol-3D and PCM-3D, where the number of cells were significantly higher in BCol-2D in relation to PCM-3D (p=0.002). At the end of the experimental period, there was an increase in total cell number in all of the experimental groups, and it was again significantly greater in BCol-2D than in PCM (p=0.005). Between 3 and 10 days, there was an increase in total cell number in ColB-3D (p<0.001), which showed higher counts within 10 days. Higher percentage of HGF in the cell cycle could be seen in BCol-2D followed by BCol-3D and PCM-3D, respectively, in all of the experimental groups. In PCM-3D there was almost no expression of Ki-67. BCol-2D showed a decrease in HGF cycling between 3 and 10 days (p=0,036). The expression of non-collagenous and cytoskeletal proteins were similar in both matrices during all the period of the study. Conclusion: PCM-3D is suitable for HGF culture, since, within the matrix, important properties were found, among them, morphology, proliferation andprotein expression, similar to those observed in a 3D collagen matrix well established in the literature.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-12072012-110036 |
| Date | 03 July 2012 |
| Creators | Mandetta, Carolina de Moraes Rego |
| Contributors | Bulle, Daniela Bazan Palioto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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