A matriz démica acelular, MDA, figura dentre os biomateriais que têm por objetivo restaurar defeitos mucogengivais. A correção de defeitos mucogengivais a partir de constituintes autógenos são os procedimentos mais comumente usados, no entanto, em decorrência da quantidade insuficiente de tecido doador, esses procedimentos se tornam limitados. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar, in vitro, diferentes aspectos relacionados ao cultivo prévio de fibroblastos gengivais humanos em MDA. Fibroblastos gengivais humanos foram cultivados pela técnica do explante a partir de amostras de tecido gengival queratinizado removido de três pacientes saudáveis. A MDA foi cultivada com esses fibroblastos por períodos de 14 e 21 dias para posterior análise dos eventos de: adesão celular, proliferação e viabilidade. Os resultados mostraram que em 7 dias, os fibroblastos estavam aderidos, espraiados e dispersos sobre a superfície externa da MDA, em 14 dias formavam monocamada de células de morfologia alongada e quiescentes (Ki-67 negativos) em sua maioria, sendo apenas ocasionalmente observadas no interior da MDA. Em 21 dias a monocamada exibia menor densidade celular. Os resultados sugerem que o cultivo de fibroblastos em MDA em períodos de 14 dias permite boas condições de adesão e espraiamento das células sobre a matriz, porém, a alta densidade de fibras colágenas parece ser um fator limitante à migração celular. / Acellular Dermal Matrix, ADM, is a biomaterial that has been used in periodontal procedures to treat mucogingival defects. Mucogingival defects can be corrected by autogenous grafts that are the most common procedure used in periodontology, however, because of the limited source of donor\'s tissue this procedure became limited. The aim of this investigation was to verify, in vitro, different aspects related to human gingival fibroblasts seeding on to the ADM. Human gingival fibroblasts were established from explant cultures from the connective tissue of keratinized gingiva collected from three healthy patients. ADM was seeded with gingival fibroblasts for 14 and 21 days, and then cell adherence, proliferation and viability were analyzed. Results revealed that, at day 7, fibroblasts were adherent and spreading on the ADM surface, and were unevenly distributed, forming a discontinuous single cell layer, at day 14, a confluent fibroblastic monolayer lining ADM surface was noticed. At day 21, the cell monolayer exhibited a reduction in cell density. The results suggests that fibroblasts seeding on the ADM for 14 days can allow good conditions for cell adhesion and spread on the matrix, however, because of the high collagen fiber bundle density cell, migration inside the matrix was limited.

A matriz démica acelular, MDA, figura dentre os biomateriais que têm por objetivo restaurar defeitos mucogengivais. A correção de defeitos mucogengivais a partir de constituintes autógenos são os procedimentos mais comumente usados, no entanto, em decorrência da quantidade insuficiente de tecido doador, esses procedimentos se tornam limitados. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar, in vitro, diferentes aspectos relacionados ao cultivo prévio de fibroblastos gengivais humanos em MDA. Fibroblastos gengivais humanos foram cultivados pela técnica do explante a partir de amostras de tecido gengival queratinizado removido de três pacientes saudáveis. A MDA foi cultivada com esses fibroblastos por períodos de 14 e 21 dias para posterior análise dos eventos de: adesão celular, proliferação e viabilidade. Os resultados mostraram que em 7 dias, os fibroblastos estavam aderidos, espraiados e dispersos sobre a superfície externa da MDA, em 14 dias formavam monocamada de células de morfologia alongada e quiescentes (Ki-67 negativos) em sua maioria, sendo apenas ocasionalmente observadas no interior da MDA. Em 21 dias a monocamada exibia menor densidade celular. Os resultados sugerem que o cultivo de fibroblastos em MDA em períodos de 14 dias permite boas condições de adesão e espraiamento das células sobre a matriz, porém, a alta densidade de fibras colágenas parece ser um fator limitante à migração celular. / Acellular Dermal Matrix, ADM, is a biomaterial that has been used in periodontal procedures to treat mucogingival defects. Mucogingival defects can be corrected by autogenous grafts that are the most common procedure used in periodontology, however, because of the limited source of donor\'s tissue this procedure became limited. The aim of this investigation was to verify, in vitro, different aspects related to human gingival fibroblasts seeding on to the ADM. Human gingival fibroblasts were established from explant cultures from the connective tissue of keratinized gingiva collected from three healthy patients. ADM was seeded with gingival fibroblasts for 14 and 21 days, and then cell adherence, proliferation and viability were analyzed. Results revealed that, at day 7, fibroblasts were adherent and spreading on the ADM surface, and were unevenly distributed, forming a discontinuous single cell layer, at day 14, a confluent fibroblastic monolayer lining ADM surface was noticed. At day 21, the cell monolayer exhibited a reduction in cell density. The results suggests that fibroblasts seeding on the ADM for 14 days can allow good conditions for cell adhesion and spread on the matrix, however, because of the high collagen fiber bundle density cell, migration inside the matrix was limited.

Baigiamajame darbe įvertintas skirtingų titano implantų paviršiaus modifikavimo strategijų poveikis pirminių dantenų fibroblastų savybėms – adhezijai, proliferacijai ir diferenciacijai. Tyrimuose naudoti titano mėginiai, kurių paviršiaus šiurkštumas pakeistas fizikiniais metodais – smėliasrove ir lazeriu. Iš gingivektomijos metu paimto ţmogaus dantenų subepitelinio audinio buvo išskirtos ir charakterizuotos dantenų fibroblastų ląstelės. Tiriant šių ląstelių adheziją ant modifikuotų titano mėginių paviršių nustatyta, kad ankstyvuoju laikotarpiu dantenų fibloblastų adhezija buvo panaši ant visų tirtų įvairiai modifikuotų titano mėginių paviršių, tačiau vėliau efektyviausias ląstelių prikibimui paviršius buvo lazeriu suformuotos grotelės. Siekiant pagerinti modifikuotų titano paviršių adhezines savybes, jie papildomai buvo padengti tarpląstelinio uţpildo baltymais – kolagenu ir lamininu, įvertintas tokio padengimo poveikis ląstelių prikibimui ir augimui. Analizuojant mechanizmus, reguliuojančius ląstelių adhezijos ant modifikuotų paviršių procesus, buvo tirta FAK ir Akt kinazių raiška ir aktyvinimas. Vertinant karkasų paviršiaus topografijos poveikį ląstelių diferenciacijai, buvo palygintas osteogeninės diferenciacijos laipsnis ląstelėse augintose ant įvairiai modifikuotų titano mėginių paviršių. Darbą sudaro 6 dalys: įvadas, literatūros apţvalga, medţiagos ir metodai, rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas. Darbo apimtis – p. teksto be priedų, 24 pav., 2 lent... [toliau žr. visą tekstą] / The influence of different modification strategies of titanium implant surfaces on gingival fibroblasts properties - adhesion, proliferation, and differentiation was studies in this final master thesis. Different titanium surface roughness modifications using physical methods such as sand-blasting as well as laser irradiation were developed. Gingival fibroblasts derived from human gingival subepithelial tissues obtained during gingivectomy were isolated and characterized. The data suggested that the initial adhesion between tested cells and various modified titanium surfaces was similar, but the most efficient surface for subsequent cell attachment was laser-ablated holey arranged in grid-like structures. Additionally, in order to improve the modified titanium surface adhesion properties, these surfaces were coated by extracellular matrix proteins - collagen and laminin. The coating influence on the cell growth and adhesion was evaluated. To analyze the mechanisms regulating cell adhesion processes on the modified surfaces, FAK and Akt kinase expression as well as activation were studied. In order to evaluate the effect of surface topography on cell differentiation, the level of osteogenic differentiation was compared. Structure: introduction, literature review, materials and methods, results and discussion, conclusions, references.

Orientador: Márcia Carneiro Valera / Banca: Idomeo Bonetti Filho / Banca: Carlos Henrique Ribeiro Camargo / Resumo: A proposta deste trabalho foi avaliar a citotoxicidade do peróxido de hidrogênio liberado por agentes clareadores, utilizados para clareamento de dentes tratados endodonticamente, sobre cultura de fibroblastos provenientes do tecido gengival humano (FMM1). As células foram cultivadas em DMEM e quando apresentaram-se em quantidade suficiente e entre a quinta e décima passagens foram plaqueadas em placas de 96 poços onde receberam os meios de cultura condicionados de acordo com os grupos experimentais (n=12): G1- Perborato de Sódio + água; G2- Perborato de sódio + Peróxido de Carbamida 20%; G3- Peróxido de Carbamida 20%; G4- Perborato de Sódio + Peróxido de Hidrogênio 35%; G5- Peróxido de Hidrogênio 35%. O grupo controle (n=12) correspondeu à curva de crescimento e viabilidade celular, onde as células não receberam tratamento. O ensaio com MTT foi realizado nos períodos de 24 e 48 horas para avaliar a viabilidade celular. Paralelamente, mediu-se em espectrofotômetro a quantidade de peróxido de hidrogênio liberado nas condições experimentais. Os dados foram analisados através dos testes de ANOVA e Tukey. Todos os grupos experimentais apresentaram diferença significativa em relação ao controle. O tempo de avaliação mostrou diferença estatística, exceto para o G1 (PS + H2O). Concluiu-se que: todos os agentes clareadores testados foram citotóxicos, diminuindo significantemente o metabolismo e viabilidade celular; a associação do perborato de sódio com água destilada foi o agente clareador mais tóxico e o peróxido de carbamida 20% o menos tóxico. / Abstract: The propose of this study was to evaluate the cytotoxicity from five bleaching agents, used for the technique of intracanal bleaching, on human gingival fibroblasts (FMM1). The cells were cultivated in DMEM and when they were presented in enough amount and between the fifth and tenth passages they were placed in plates of 96 wells; where they received the conditional culture according to the experimental groups (n=12): G1- SP + H2O; G2- SP + CP20%; G3- CP20%; G4- SP + HP35%; G5- HP35%. The control group (n=12) corresponded to the curve of cell growth and viability, where the cells didn't receive any treatment. The MTT assay was carried through in the periods of 24 and 48 hours to evaluate the cellular viability. The amount of set free hydrogen peroxide in the experimental conditions was also measured in a spectrophotometer. The data were submitted to statistical analysis of variance and Turkey's test. All the experimental groups presented significant difference in comparison to the control. The evaluation time showed statistical difference, except for the G1 (SP + H2O). Conclusion: all the bleaching agents had showed cytotoxicity effects, reducing significantly the cell metabolism and viability; the association of sodium perborate with distilled water was the most toxic bleaching agent and carbamide peroxide 20% the least. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29Bitstream added on 2014-06-13T20:31:48Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_amm_me_sjc.pdf: 332962 bytes, checksum: f4c47a3efef5e5b260cbd7ef4a2f1c60 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A proposta deste trabalho foi avaliar a citotoxicidade do peróxido de hidrogênio liberado por agentes clareadores, utilizados para clareamento de dentes tratados endodonticamente, sobre cultura de fibroblastos provenientes do tecido gengival humano (FMM1). As células foram cultivadas em DMEM e quando apresentaram-se em quantidade suficiente e entre a quinta e décima passagens foram plaqueadas em placas de 96 poços onde receberam os meios de cultura condicionados de acordo com os grupos experimentais (n=12): G1- Perborato de Sódio + água; G2- Perborato de sódio + Peróxido de Carbamida 20%; G3- Peróxido de Carbamida 20%; G4- Perborato de Sódio + Peróxido de Hidrogênio 35%; G5- Peróxido de Hidrogênio 35%. O grupo controle (n=12) correspondeu à curva de crescimento e viabilidade celular, onde as células não receberam tratamento. O ensaio com MTT foi realizado nos períodos de 24 e 48 horas para avaliar a viabilidade celular. Paralelamente, mediu-se em espectrofotômetro a quantidade de peróxido de hidrogênio liberado nas condições experimentais. Os dados foram analisados através dos testes de ANOVA e Tukey. Todos os grupos experimentais apresentaram diferença significativa em relação ao controle. O tempo de avaliação mostrou diferença estatística, exceto para o G1 (PS + H2O). Concluiu-se que: todos os agentes clareadores testados foram citotóxicos, diminuindo significantemente o metabolismo e viabilidade celular; a associação do perborato de sódio com água destilada foi o agente clareador mais tóxico e o peróxido de carbamida 20% o menos tóxico. / The propose of this study was to evaluate the cytotoxicity from five bleaching agents, used for the technique of intracanal bleaching, on human gingival fibroblasts (FMM1). The cells were cultivated in DMEM and when they were presented in enough amount and between the fifth and tenth passages they were placed in plates of 96 wells; where they received the conditional culture according to the experimental groups (n=12): G1- SP + H2O; G2- SP + CP20%; G3- CP20%; G4- SP + HP35%; G5- HP35%. The control group (n=12) corresponded to the curve of cell growth and viability, where the cells didn’t receive any treatment. The MTT assay was carried through in the periods of 24 and 48 hours to evaluate the cellular viability. The amount of set free hydrogen peroxide in the experimental conditions was also measured in a spectrophotometer. The data were submitted to statistical analysis of variance and Turkey’s test. All the experimental groups presented significant difference in comparison to the control. The evaluation time showed statistical difference, except for the G1 (SP + H2O). Conclusion: all the bleaching agents had showed cytotoxicity effects, reducing significantly the cell metabolism and viability; the association of sodium perborate with distilled water was the most toxic bleaching agent and carbamide peroxide 20% the least.

Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção do periodonto. Alloderm® (MDA) é um substituto alógeno muito utilizado e estudado em periodontia. O objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, se a MDA é uma matriz tridimensional adequada, através de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais e células neoplásicas; e, ainda, se os subprodutos da MDA influenciam o comportamento celular. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais de cão (FGC) e fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de, respectivamente, três indivíduos e três cães saudáveis. As células FGC, FGH e B16F10 de melanoma murino foram cultivadas sobre a MDA por até 14 dias. Os seguintes parâmetros foram avaliados: presença, morfologia e distribuição de FGC, FGH e B16F10 por fluorescência direta; viabilidade de FGC e FGH por MTT; e o efeito do meio de cultura condicionado (MC) em MDA por 24 h na viabilidade celular de FGC por MTT. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, seguido pelo método de Dunn para comparações múltiplas (nível de significância: 5%). Resultados: A epifluorescência revelou que, em 12 h, FGH e FGC estavam aderidos à superfície da MDA em baixa densidade celular, exibindo morfologia poligonal com núcleos esféricos, enquanto que, aos 7 e 14 dias, essas células apresentavam com formato alongado, núcleos ovalados e citoesqueleto de actina com fibras de estresse. Aos 7 e 14 dias, FGC apresentavam-se distribuídos de forma desigual sobre a MDA, formando uma camada celular descontínua, sem aumento no número de células entre os períodos; FGH formaram uma monocamada celular na superfície da MDA, estando presentes em maior número após 14 dias de cultivo (p<0,05); e B16F10 exibiram um aumento no número de células de 12 h para 7 dias (p<0,05), apresentando-se dispostas em aglomerados celulares, principalmente na superfície da MDA, com a formação de camada contínua aos 14 dias. Notou-se maior número de células nas amostras cultivadas com B16F10, seguido por FGH e FGC aos 7 dias (p<0,05). Aos 14 dias, FGH e B16F10 estavam presentes em maior número, com diferença estatística significante em relação aos FGC (p<0,05). Foi observada maior porcentagem de células na superfície (p<0,05) do que no interior da MDA e essa proporção manteve-se estável durante os períodos avaliados para todos os tipos celulares. O ensaio de MTT indicou maior viabilidade celular nas amostras cultivadas com FGH comparado a FGC (p=0,024), aos 7 e 14 dias. Notou-se um decréscimo na viabilidade celular em culturas cultivadas em MC, com diferença estatística entre os grupos em 48 e 72 horas (p<0,05). Conclusão: Podemos concluir que fibroblastos gengivais e mesmo células altamente proliferativas, como B16F10, povoam apenas superficialmente a MDA e que FGC são afetados negativamente pelos subprodutos da MDA, reduzindo sua viabilidade. / Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Alloderm® (Alloderm® - ADM) is the most used and studied allogeneic substitute. The aim of this investigation was to verify if ADM is a suitable threedimensional matrix, through its in vitro response to gingival fibroblasts and cancerous cells lineage and, also, if ADM end products affect cellular behavior. Methods: Canine gingival fibroblasts (CGF) and human gingival fibroblasts (HGF) cultures were established by the explant technique of gingival connective tissues of three dogs and three healthy patients, respectively. CGF, HGF and B16F10 cells of murine melanoma were seeded on ADM and grown for up to 14 days. The following parameters were assessed: presence, morphology and distribution of CGF, HGF e B16F10 by direct fluorescence; CGF and HGF viability by MTT; and the effect of culture medium conditioned (CM) in the MDA for 24 h on CGF viability by MTT. Quantitative data were submitted to Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, followed by Dunn\'s method. Results: Epifluorescence revealed that CGF and HGF were adherent and exhibited a polygonal morphology at 12 h while at 7 and 14 days they were spread, exhibiting an elongated shape and the actin cytoskeleton assembled into stress fibers. CGF were unevenly distributed on ADM surface, showing no increase in cell number over the experimental periods; HGF formed a monolayer on the ADM surface, in a higher number at 14 days (p<0,05); B16F10 exhibited na increase in cell number in 7 days (p<0,05), and were mainly arranged in cell aggregates on the ADM, forming a continuous layer at 14 days. A higher percentage of cells on the ADM surface (p <0.05) compared to inside the matrix was observed for all cell types in all periods. MTT values indicated higher cell viability in samples cultured with HGF compared to CGF (p=0.024). A significantly lower cell viability for CGF grown in CM compared to cells grown in non conditioned medium at 48 and 72 h (p <0.05) was noticed. Conclusion: Gingival fibroblasts and even highly proliferative cells as B16F10 can be only superficially located on ADM and CGF are negatively affected by ADM end products, reducing its viability.

Estudos relataram a atividade antimicrobina de Equisetum giganteum e Punica granatum, reduzindo o risco do desenvolvimento da estomatite protética, doença relacionada principalmente à colonização das próteses pelo fungo Candida albicans. Diante disso, é necessário que essas plantas sejam bem toleradas pelos tecidos bucais e, se possível, auxiliem no processo de reparo. Objetivo: Realizar um estudo fitoquímico de substâncias potencialmente ativas de Equisetum giganteum e Punica granatum e avaliar a viabilidade de fibroblastos gengivais humanos frente a diferentes concentrações destas plantas, após diferentes períodos in vitro. Material e Métodos: Após a identificação dos compostos das plantas por HPLC-PAD, foram selecionadas as frações com melhor atividade antifúngica perante Candida albicans. Os extratos brutos e frações selecionadas de P. granatum e E. giganteum foram testados em diferentes concentrações (0.23, 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5, 15 e 30 mg) e períodos (12, 24, 36 e 60 h) sobre fibroblastos gengivais humanos (FGH), para a avaliação de suas citotoxicidades através da análise da viabilidade dos FGH, pelo ensaio LIVE/DEAD. Por meio desse ensaio, analisamos quantitativamente a viabilidade celular através das leituras das unidades relativas de fluorescência (URF) e qualitativamente por meio da analise da morfologia e da densidade observadas pela microscopia invertida de fluorescência, após três experimentos independentes para cada período de avaliação. Os resultados quantitativos paramétricos foram representados como média e desvio padrão (SD) com análise de Variância ANOVAOne- Way, seguida da análise comparativa pelo teste de Tukey HSD. Os resultados quantitativos não paramétricos foram apresentados como mediana e quartis e foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido de análise comparativa pelo teste de Dunn, de acordo com as análises de normalidade (Teste de Kolmogorov-Smirnov). Valores de p< 0.05 foram indicativos de significância estatística. Conclusões: Foram identificados compostos fenólicos, como flavonoides e taninos em E.giganteum e P. granantum, respectivamente. Identificamos uma citotoxicidade concentração-dependente para as duas plantas testadas, independente do tempo. Sob as menores concentrações das plantas a viabilidade e a morfologia dos FGH foram preservadas. Dentro deste contexto, acreditamos na possibilidade de se utilizar essas plantas como terapia alternativa em diversas áreas de saúde, porém em concentrações biocompatíveis. / Studies have reported the antimicrobial activity of Equisetum giganteum and Punica granatum, reducing the risk of development of denture stomatitis, a disease mainly related to the colonization of prostheses by the fungus Candida albicans. In view of this, it is necessary that these plants be well tolerated by the oral tissues and, if possible, assist in the repair process. Objective: To carry out a phytochemical study of potentially active substances of E. giganteum and P. granatum and to evaluate the viability of human gingival fibroblasts against different concentrations of these two plants, after different periods in vitro. Material and Methods: After the identification of the plant compounds by HPLC-PAD, the fractions with the best antifungal activity against Candida albicans were selected. The crude extracts and selected fractions of P. granatum and E. giganteum were tested at different concentrations (0.23, 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5, 15 and 30 mg) and periods (12, 24, 36 and 60 h) against human gingival fibroblasts (FGH), for the evaluation of their possible cytotoxicity through the analysis of the viability of FGH by the LIVE/DEAD assay. By means of this assay we quantitatively analyzed the cell viability through the readings of the relative units of fluorescence (URF) and qualitatively by analysis of the cellular morphology and density using inverted fluorescence microscopy, after three independent experiments. The parametric quantitative results were represented as mean and standard deviation (SD) with ANOVA-One-Way Variance analysis, followed by comparative analysis by the Tukey HSD test. The non-parametric quantitative results were presented as medians and quartiles and were submitted to the Kruskal-Wallis test, followed by comparative analysis by the Dunn test, according to normality tests (Kolmogorov-Smirnov test). Values of p <0.05 were indicative of statistical significance. Conclusions: Phenolic compounds, such as flavonoids and tannins, were identified in E. giganteum and P. granantum, respectively. We identified a concentration-dependent cytotoxicity for the two plants tested, regardless of the time. Under the lowest concentrations of plants the viability and morphology of FGH were preserved when compared to the control. Within this context, we believe in the possibility to use these plants as alternative therapy in several health areas, but in biocompatible concentrations.

Introdução: Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção. Mucograft® (MCS-3D) é um substituto xenógeno novo que vem sendo utilizado na periodontia em técnicas de recobrimento radicular e aumento de tecido queratinizado. O objetivo do presente estudo foi avaliar morfológica e imunohistoquimicamente, se a MCS-3D é uma matriz tridimensional adequada, por meio de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de três indivíduos. Os FGH foram cultivados sobre colágeno bovino bidimensional (ColB-2D), colágeno bovino tridimensional (ColB-3D) e matriz colágena suína tridimensional (MCS-3D) por até 10 dias. Em 3, 7 e 10 dias, os seguintes parâmetros foram avaliados: número, morfologia e distribuição de FGH por fluorescência direta; viabilidade celular por MTT; proliferação celular e expressão de proteínas citoesqueléticas: actina e tubulina e proteínas da matriz extracelular não colágena: fibronectina imunofluorescência indireta. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos de Friedman para comparação intra e intergrupos para as variáveis da análise de expressão das proteínas: fibronectina, actina e tubulina. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparações intra e intergrupos, seguido do teste de Tukey para as variáveis das análises de viabidlidade, proliferação e número total de células. Resultados: A epifluorescência revelou que em 3 dias os FGH apresentavam-se aderidos em todos os grupos experimentais. FGH cultivados sobre ColB-2D exibiram forma menos alongada, ampla e achatada com maior quantidade de projeções e numerosas fibras de estresse em 3, 7 e 10 dias. Por outro lado, os FGH cultivados sobre ColB-3D e MCS-3D demonstraram, em todos os períodos experimentais, fenótipo fusiforme, alongado ou cilíndrico com menor quantidade de projeções do que observado no substrato 2D, com algumas das células cultivadas sobre MCS-3D demonstrando aspecto estrelado. O ensaio de MTT revelou viabilidade celular significantemente superior no ColB-2D e MCS-3D do que no ColB-3D (p<0,001), em todos os períodos experimentais. Em 3 dias, foi observado maior número de FGH cultivados sobre ColB-2D seguido por MCS-3D e ColB-3D respectivamente, havendo diferença estatística entre ColB-2D e MCS-3D (p<0,001) e entre ColB-2D e ColB-3D (p<0,001). No sétimo dia houve redução no número de células no ColB-2D e aumento na MCS-3D e ColB-3D, em que o número de células foi significantemente superior no ColB-2d com relação a MCS-3D (p=0,002). Ao final do período experimental, foi observado aumento no número de células em todos os grupos experimentais, sendo o número de células, mais uma vez, significantemente superior no ColB-2D do que na MCS-3D (p=0,002). Maior porcentagem de FGH no ciclo celular pode ser observado em ColB-2D seguido por ColB-3D e MCS-3D, respectivamente, em todos os períodos experimentais. Na MCS-3D praticamente não houve marcação por Ki-67 e o ColB-2D apresentou redução significativa de FGH ciclando entre o período de 3 e 10 dias (p=0,036). A expressão de proteínas não colágenas e citoesqueléticas foi similar em ambas as matrizes experimentais durante todo o estudo. Conclusão: Podemos concluir que a MCS-3D constitui uma matriz adequada para o cultivo de fibroblastos gengivais humanos, uma vez que, no interior da matriz, importantes propriedades foram verificadas, dentre as quais, morfologia, proliferação, e expressão de proteínas, semelhantes a uma matriz colágena tridimensional já consagrada na literatura. / Introduction: Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Mucograft® (PCM-3D) is a new xenogeneic substitute that has been used in periodontics in techniques such as root coverage and increasing keratinized tissue. The aim of this investigation was to verify if PCM-3D is a suitable three-dimensional matrix though its in vitro response to the culture of HGF. Methods: Human gingival fibroblasts (HGF) culture was established by the explant technique of gingival connective tissues of three healthy patients. HGF were seeded on bidimensional bovine collagen matrix (BCol-2D), three-dimensional bovine collagen matrix (BCol- 3D) and three-dimensional porcine collagen matrix (PCM-3D). HGF were grown for up to 10 days. At 3, 7 and 10 days the following parameters were assessed: HGF number, morphology and distribution by direct fluorescence; cell viability by MTT; cell proliferation and expression of proteins of the extracellular matrix non-collagenous fibronectina and cytoeskeletic - proteins actin and tubulin by indirect immunofluorescence. Quantitative data were submitted to Friedman and Kruskal- Wallis test, and the last one was followed by Tukeys test. Results: Epifluorescence revealed that at 3 days HGF grown on BCol-2D were broader, more flattened and had more cell protrusions and stress fibers in all experimental times. On the other hand, HGF seeded on BCol-3D and PCM-3D displayed a spindle-shaped, elongated, or cylindrical phenotype with fewer protrusions as well as less total cell spread area than on the 2D matrix, with some cells on PCM-3D showing stellate appearance. MTT assay showed cell viability higher in cultures grown on BCol-2D and PCM-3D than in BCol-3D (p<0,001). At 3days a greater number of cells in BCol-2D samples followed by PCM-3D and BCol-3D, respectively, was observed with statistical difference between BCol-2D and PCM-3D and between (p<0,001). At 7 days, there was a decrease in cell number grown on BCol-2D and an increase in BCol-3D and PCM-3D, where the number of cells were significantly higher in BCol-2D in relation to PCM-3D (p=0.002). At the end of the experimental period, there was an increase in total cell number in all of the experimental groups, and it was again significantly greater in BCol-2D than in PCM (p=0.005). Between 3 and 10 days, there was an increase in total cell number in ColB-3D (p<0.001), which showed higher counts within 10 days. Higher percentage of HGF in the cell cycle could be seen in BCol-2D followed by BCol-3D and PCM-3D, respectively, in all of the experimental groups. In PCM-3D there was almost no expression of Ki-67. BCol-2D showed a decrease in HGF cycling between 3 and 10 days (p=0,036). The expression of non-collagenous and cytoskeletal proteins were similar in both matrices during all the period of the study. Conclusion: PCM-3D is suitable for HGF culture, since, within the matrix, important properties were found, among them, morphology, proliferation andprotein expression, similar to those observed in a 3D collagen matrix well established in the literature.

Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção do periodonto. Alloderm® (MDA) é um substituto alógeno muito utilizado e estudado em periodontia. O objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, se a MDA é uma matriz tridimensional adequada, através de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais e células neoplásicas; e, ainda, se os subprodutos da MDA influenciam o comportamento celular. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais de cão (FGC) e fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de, respectivamente, três indivíduos e três cães saudáveis. As células FGC, FGH e B16F10 de melanoma murino foram cultivadas sobre a MDA por até 14 dias. Os seguintes parâmetros foram avaliados: presença, morfologia e distribuição de FGC, FGH e B16F10 por fluorescência direta; viabilidade de FGC e FGH por MTT; e o efeito do meio de cultura condicionado (MC) em MDA por 24 h na viabilidade celular de FGC por MTT. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, seguido pelo método de Dunn para comparações múltiplas (nível de significância: 5%). Resultados: A epifluorescência revelou que, em 12 h, FGH e FGC estavam aderidos à superfície da MDA em baixa densidade celular, exibindo morfologia poligonal com núcleos esféricos, enquanto que, aos 7 e 14 dias, essas células apresentavam com formato alongado, núcleos ovalados e citoesqueleto de actina com fibras de estresse. Aos 7 e 14 dias, FGC apresentavam-se distribuídos de forma desigual sobre a MDA, formando uma camada celular descontínua, sem aumento no número de células entre os períodos; FGH formaram uma monocamada celular na superfície da MDA, estando presentes em maior número após 14 dias de cultivo (p<0,05); e B16F10 exibiram um aumento no número de células de 12 h para 7 dias (p<0,05), apresentando-se dispostas em aglomerados celulares, principalmente na superfície da MDA, com a formação de camada contínua aos 14 dias. Notou-se maior número de células nas amostras cultivadas com B16F10, seguido por FGH e FGC aos 7 dias (p<0,05). Aos 14 dias, FGH e B16F10 estavam presentes em maior número, com diferença estatística significante em relação aos FGC (p<0,05). Foi observada maior porcentagem de células na superfície (p<0,05) do que no interior da MDA e essa proporção manteve-se estável durante os períodos avaliados para todos os tipos celulares. O ensaio de MTT indicou maior viabilidade celular nas amostras cultivadas com FGH comparado a FGC (p=0,024), aos 7 e 14 dias. Notou-se um decréscimo na viabilidade celular em culturas cultivadas em MC, com diferença estatística entre os grupos em 48 e 72 horas (p<0,05). Conclusão: Podemos concluir que fibroblastos gengivais e mesmo células altamente proliferativas, como B16F10, povoam apenas superficialmente a MDA e que FGC são afetados negativamente pelos subprodutos da MDA, reduzindo sua viabilidade. / Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Alloderm® (Alloderm® - ADM) is the most used and studied allogeneic substitute. The aim of this investigation was to verify if ADM is a suitable threedimensional matrix, through its in vitro response to gingival fibroblasts and cancerous cells lineage and, also, if ADM end products affect cellular behavior. Methods: Canine gingival fibroblasts (CGF) and human gingival fibroblasts (HGF) cultures were established by the explant technique of gingival connective tissues of three dogs and three healthy patients, respectively. CGF, HGF and B16F10 cells of murine melanoma were seeded on ADM and grown for up to 14 days. The following parameters were assessed: presence, morphology and distribution of CGF, HGF e B16F10 by direct fluorescence; CGF and HGF viability by MTT; and the effect of culture medium conditioned (CM) in the MDA for 24 h on CGF viability by MTT. Quantitative data were submitted to Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, followed by Dunn\'s method. Results: Epifluorescence revealed that CGF and HGF were adherent and exhibited a polygonal morphology at 12 h while at 7 and 14 days they were spread, exhibiting an elongated shape and the actin cytoskeleton assembled into stress fibers. CGF were unevenly distributed on ADM surface, showing no increase in cell number over the experimental periods; HGF formed a monolayer on the ADM surface, in a higher number at 14 days (p<0,05); B16F10 exhibited na increase in cell number in 7 days (p<0,05), and were mainly arranged in cell aggregates on the ADM, forming a continuous layer at 14 days. A higher percentage of cells on the ADM surface (p <0.05) compared to inside the matrix was observed for all cell types in all periods. MTT values indicated higher cell viability in samples cultured with HGF compared to CGF (p=0.024). A significantly lower cell viability for CGF grown in CM compared to cells grown in non conditioned medium at 48 and 72 h (p <0.05) was noticed. Conclusion: Gingival fibroblasts and even highly proliferative cells as B16F10 can be only superficially located on ADM and CGF are negatively affected by ADM end products, reducing its viability.

Estudos relataram a atividade antimicrobina de Equisetum giganteum e Punica granatum, reduzindo o risco do desenvolvimento da estomatite protética, doença relacionada principalmente à colonização das próteses pelo fungo Candida albicans. Diante disso, é necessário que essas plantas sejam bem toleradas pelos tecidos bucais e, se possível, auxiliem no processo de reparo. Objetivo: Realizar um estudo fitoquímico de substâncias potencialmente ativas de Equisetum giganteum e Punica granatum e avaliar a viabilidade de fibroblastos gengivais humanos frente a diferentes concentrações destas plantas, após diferentes períodos in vitro. Material e Métodos: Após a identificação dos compostos das plantas por HPLC-PAD, foram selecionadas as frações com melhor atividade antifúngica perante Candida albicans. Os extratos brutos e frações selecionadas de P. granatum e E. giganteum foram testados em diferentes concentrações (0.23, 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5, 15 e 30 mg) e períodos (12, 24, 36 e 60 h) sobre fibroblastos gengivais humanos (FGH), para a avaliação de suas citotoxicidades através da análise da viabilidade dos FGH, pelo ensaio LIVE/DEAD. Por meio desse ensaio, analisamos quantitativamente a viabilidade celular através das leituras das unidades relativas de fluorescência (URF) e qualitativamente por meio da analise da morfologia e da densidade observadas pela microscopia invertida de fluorescência, após três experimentos independentes para cada período de avaliação. Os resultados quantitativos paramétricos foram representados como média e desvio padrão (SD) com análise de Variância ANOVAOne- Way, seguida da análise comparativa pelo teste de Tukey HSD. Os resultados quantitativos não paramétricos foram apresentados como mediana e quartis e foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido de análise comparativa pelo teste de Dunn, de acordo com as análises de normalidade (Teste de Kolmogorov-Smirnov). Valores de p< 0.05 foram indicativos de significância estatística. Conclusões: Foram identificados compostos fenólicos, como flavonoides e taninos em E.giganteum e P. granantum, respectivamente. Identificamos uma citotoxicidade concentração-dependente para as duas plantas testadas, independente do tempo. Sob as menores concentrações das plantas a viabilidade e a morfologia dos FGH foram preservadas. Dentro deste contexto, acreditamos na possibilidade de se utilizar essas plantas como terapia alternativa em diversas áreas de saúde, porém em concentrações biocompatíveis. / Studies have reported the antimicrobial activity of Equisetum giganteum and Punica granatum, reducing the risk of development of denture stomatitis, a disease mainly related to the colonization of prostheses by the fungus Candida albicans. In view of this, it is necessary that these plants be well tolerated by the oral tissues and, if possible, assist in the repair process. Objective: To carry out a phytochemical study of potentially active substances of E. giganteum and P. granatum and to evaluate the viability of human gingival fibroblasts against different concentrations of these two plants, after different periods in vitro. Material and Methods: After the identification of the plant compounds by HPLC-PAD, the fractions with the best antifungal activity against Candida albicans were selected. The crude extracts and selected fractions of P. granatum and E. giganteum were tested at different concentrations (0.23, 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5, 15 and 30 mg) and periods (12, 24, 36 and 60 h) against human gingival fibroblasts (FGH), for the evaluation of their possible cytotoxicity through the analysis of the viability of FGH by the LIVE/DEAD assay. By means of this assay we quantitatively analyzed the cell viability through the readings of the relative units of fluorescence (URF) and qualitatively by analysis of the cellular morphology and density using inverted fluorescence microscopy, after three independent experiments. The parametric quantitative results were represented as mean and standard deviation (SD) with ANOVA-One-Way Variance analysis, followed by comparative analysis by the Tukey HSD test. The non-parametric quantitative results were presented as medians and quartiles and were submitted to the Kruskal-Wallis test, followed by comparative analysis by the Dunn test, according to normality tests (Kolmogorov-Smirnov test). Values of p <0.05 were indicative of statistical significance. Conclusions: Phenolic compounds, such as flavonoids and tannins, were identified in E. giganteum and P. granantum, respectively. We identified a concentration-dependent cytotoxicity for the two plants tested, regardless of the time. Under the lowest concentrations of plants the viability and morphology of FGH were preserved when compared to the control. Within this context, we believe in the possibility to use these plants as alternative therapy in several health areas, but in biocompatible concentrations.