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Previous issue date: 2006-08-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Endophytic microorganisms can be utilized in distinct ways in Biotechnology science. Among them, one of most interesting uses is as heterologue gene carriers into plants, allowing the development of new Biotechnologic processes, which makes relevant the development of vectors from native plasmids from the endophytic bacterias itselves for genetic transformation of this kind of bacteria. Studies involving Enterobacter agglomerans, a endophytic bacteria isolated from Copaifera multijuga (copaiba tree), demonstrated the presence of a small, cryptic plasmid named pEA1. Based on this plasmid, the pEA1.0 and pEA2.4 plasmids were developed. pEA1.0 was built from a fragment of PstI (1000 bp), cloned in pUC18. pEA2.4 was developed from an amplified fragment (2415 bp), cloned in the vector pCR2.1TOPO (Invitrogen), which allowed, by primer walking, the determination of the complete sequence of the original plasmid (2545 bp), which had been previously recorded in GenBank (access DQ659147). The sequence analysis showed a GC level of 34% and an AT level of 66%. The restriction map was determined using NEBCutter2.0. Comparison between pEA1 sequence and the data bank revealed high similarity (62%) with the sequence of the pIGMS31 plasmid (2520 bp) from Klebsiella pneumoniae. Using the BlastX and ORF finder softwares, the result demonstrated the presence of two ORFs, one of them similar (E value=-98) to ORF2 of pIGMS31 (AY543072.1) isolated from K. pneumoniae. The pEA2.4 plasmid was used to genetically transform Escherichia coli and E. agglomerans by the Tris-calcium/thermal shock method. Besides the capability of pEA2.4 to genetically transform E. coli cells, it has showed itself capable of transforming E. agglomerans as well, which can actually acquire resistance to kanamicine. This reflects the bifunctional chacter of pEA2.4. The transformation efficacy of E. agglomerans using pEA2.4 extracted from E. coli was about 5 x 104 T/μg, while the same process with pEA2.4 extracted from E. agglomerans itself showed a ten times higher efficacy (5,1 x 105 T/μg), probably because of the avoidance of host restriction. The pEA2.4 plasmid will be used as foundation for the development of heterologue gene expression vectors in E. agglomerans. / Microrganismos endofíticos podem ser utilizados de diversas formas em biotecnologia. Dentre estas, se destaca o uso como carreadores de genes heterólogos para o interior de plantas possibilitando o desenvolvimento de novos processos biotecnológicos, o que torna relevante o desenvolvimento de vetores a partir de plasmídeos nativos das próprias bactérias endofíticas para transformação genética desse tipo de bactérias. Estudos envolvendo a Enterobacter agglomerans, uma bactéria endofítica isolada de Copaifera multijuga (copaíba) demonstraram a presença de um pequeno plasmídeo críptico denominado pEA1. Com base neste plasmídeo foram desenvolvidos os plasmídeos pEA1.0 e pEA2.4. O pEA1.0 foi construído a partir do fragmento de PstI (1000 pb) clonado em pUC18. O plasmídeo pEA2.4 foi desenvolvido a partir de um fragmento amplificado (2415 pb) clonado no vetor pCR2.1TOPO (INVITROGEN), o qual por primer walking permitiu a determinação da seqüência completa do plasmídeo original (2545 pb), que foi depositada no GenBank (acesso DQ659147). A análise da seqüência mostrou um índice GC de 34% e AT de 66%, e o mapa de restrição foi determinado utilizando a ferramenta NEBCutter2.0. Comparando a seqüência do pEA1 com o banco de dados, observou-se alta similaridade (62%) com a seqüência do plasmídeo pIGMS31 (2520 pb) de Klebsiella pneumoniae. Utilizando as ferramentas BlastX e ORF finder, o resultado demonstrou a presença de duas ORFs, sendo uma delas similar (E value = -98) à ORF2 do plasmídeo pIGMS31 (AY543072.1) isolado de K. pneumoniae. O plasmídeo pEA2.4 foi utilizado para transformar geneticamente bactérias Escherichia coli e E. agglomerans pelo método Tris-Cálcio/choque térmico. O pEA2.4 além de ser capaz de transformar geneticamente células de E. coli, mostrou-se também capaz de transformar geneticamente a E. agglomerans tornando-a resistente a canamicina, evidenciando seu caráter bifuncional. A eficiência de transformação da E. agglomerans com pEA2.4 extraído de E. coli foi de 5 x 104 T/μg, enquanto que a transformação desta bactéria com o pEA2.4 extraído da própria E. agglomerans, apresentou eficiência 1 ordem de grandeza maior (5,1 x 105 T/μg) provavelmente por ter sido, desta forma, evitado o processo de restrição da hospedeira. O plasmídeo pEA2.4 será utilizado como base para o desenvolvimento de vetores de expressão de genes heterólogos em E. agglomerans.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/2241 |
| Date | 28 August 2006 |
| Creators | Nascimento, Alessandra Karisa Costa Lima do |
| Contributors | Astolfi Filho, Spartaco, Andrade, Edmar Vaz de |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, BR, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600 |
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