Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Immobilized enzymes provide many advantages when compared to the usage of their free forms. Among these ones, remarkable advantages are the possibility of the biocatalyst reusability, easy separation at the end of the process, its usage in continuous way and the enhancement of its stability. This work was performed aiming the immobilization of the α-galactosidase enzyme from Aspergillus niger in ion exchange resin and the evaluation of its catalytic activity. Firstly, tests were performed in five different resins: Amberlite 252-Na, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C, Duolite A-568 e Duolite S-761. According to the results, Duolite A-568 was chosen as the best support. Therefore, studies were done aiming the optimization of the immobilization process in this resin. Glutaraldehyde 1% (v/v) was used before the enzyme adsorption process and it enhanced the operational stability of the immobilized enzyme. Preliminary tests did not showed difference for the immobilization process at the temperatures of 25 and 40°C. A full factorial design and a central composite design were performed to study the best immobilization conditions varying the pH, the α-galactosidase concentration and the immobilization time. The results led to use the following immobilization conditions: pH 4.5; 15 g/L of α-galactosidase and 3 hours of immobilization. The temperature of maximum activity occurred at 60°C for both free and immobilized enzyme. The activation energy calculated by linear adjustment of Arrhenius equation was 5.66 kcal/mol for soluble α-galactosidase and 4.48 kcal/mol for immobilized α-galactosidase. The optimum pH range obtained for free enzyme was 4.0-5.0 and for immobilized enzyme it was 3.0-6.0. The immobilization process improved the α-galactosidase activity in alkaline pHs. Analysis of pH stability showed that both forms of enzyme were resistant for the pH ranges studied (3.5 to 7.5 for free and 3.0 to 8.0 for immobilized). However, the thermal stability of the biocatalyst immobilized in the support decreased. The kinetic studies without inhibition showed closed values of maximum speed (Vmax) for both enzyme forms (194.5 U for free and 187.7 U for immobilized). Although, the Michaelis-Menten constant (Km) of immobilized enzyme was higher than the free one (18.8 and 12.5 g/L, respectively). The hydrolysis reaction of raffinose was inhibited by the addition of the reaction products, sucrose and galactose, and the results of inhibition by galactose pointed for the competitive inhibition type. Then, storage tests of immobilized α-galactosidase showed that the enzyme maintained its activity even after 145 days when kept at the temperature of 4°C. / O uso de enzimas imobilizadas proporciona muitas vantagens em relação ao seu uso na forma livre. Dentre estas vantagens se destacam a possibilidade de reutilização do biocatalisador, a sua fácil separação ao final do processo, a utilização em modo contínuo e o aumento de sua estabilidade. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de imobilizar a enzima α-galactosidase de Aspergillus niger em resina de troca iônica e avaliar a sua atividade catalítica. Inicialmente, foram feitos testes preliminares de imobilização em 5 tipos de resinas: Amberlite 252-Na, Dowex Marathon A, Dowex Marathon C, Duolite A-568 e Duolite S-761. Pelos resultados obtidos, Duolite A-568 foi selecionada como melhor suporte e, portanto, estudos foram feitos para a otimização do processo de imobilização nesta resina. Glutaraldeído na concentração de 1% (v/v) foi utilizado anteriormente ao processo de adsorção da enzima e melhorou a estabilidade operacional da α-galactosidase imobilizada. Testes preliminares não indicaram diferença do processo de imobilização para temperaturas de 25 e 40°C. Realizou-se um planejamento fatorial completo e um planejamento composto central para estudar as melhores condições de imobilização variando-se o pH, concentração de α-galactosidase e tempo de imobilização. Os resultados obtidos levaram a utilizar as seguintes condições de imobilização: pH 4,5, concentração de α-galactosidase de 15 g/L e tempo de imobilização de 3 horas. A temperatura de máxima atividade enzimática foi 60°C tanto para a enzima livre quanto imobilizada. O valor da energia de ativação encontrado pelo ajuste linear da equação de Arrhenius foi de 5,66 kcal/mol para α-galactosidase solúvel e 4,48 kcal/mol para α-galactosidase imobilizada. A faixa de pH ótimo obtido para a enzima livre foi 4,0-6,0 e para a enzima imobilizada foi 3,0-6,0. O processo de imobilização melhorou a atividade da α-galactosidase para pHs mais alcalinos. A análise de resistência ao pH mostrou que ambas as formas da enzima foram resistentes para as faixas estudadas (3,5 a 7,5 para livre e 3,0 a 8,0 para imobilizada). No entanto, a resistência térmica do biocatalisador retido no suporte foi menor. O estudo cinético sem inibição apresentou valores de velocidade máxima (Vmáx) próximos para as duas formas da α-galactosidase (194,5 U para livre e 187,7 U para imobilizada), porém o Km da forma imobilizada foi maior que o da livre (18,8 g/L e 12, 5 g/L de rafinose, respectivamente). A reação de hidrólise da rafinose foi inibida pela adição dos produtos da reação, sacarose e galactose, sendo que os resultados de inibição por galactose apontam para o tipo de inibição competitiva Por fim, testes de estocagem da α-galactosidase imobilizada mostraram que a enzima manteve sua atividade mesmo após 145 dias mantida a temperatura de 4°C. / Mestre em Engenharia Química
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15182 |
| Date | 27 July 2012 |
| Creators | Costa, Henrique Coutinho de Barcelos |
| Contributors | Ribeiro, Eloizio Julio, Resende, Miriam Maria de, Cardoso, Vicelma Luiz, Vieira, Patrícia Angélica, Okura, Mônica Hitomi |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFU, BR, Engenharias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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