Se conoce ampliamente que la confiabilidad de una colonia de cría de
ratones para un determinado experimento puede ser solamente demostrada
mediante un comprensivo monitoreo del estado de salud de los animales antes
y durante el experimento. En este trabajo se han desarrollado las técnicas de
inmunofluorescencia indirecta (IFI) y enzimoinmunoensayo (ELISA) para la
detección de anticuerpos contra el virus Sendai, virus de la hepatitis murina y el
virus diminuto o minuto de ratón en las colonias de cría del ratón, considerados
los agentes virales más prevalentes en las colonias SPF de ratones. Se estudió
la cinética de replicación para cada virus mediante la cosecha de células y
sobrenadantes respectivos, en diferentes días post inoculación (pi).Se obtuvo
una Semilla Maestra y una Semilla de Trabajo para el virus Sendai mediante la
inoculación del virus en huevos embrionados de pollo. La Semilla de Trabajo
sin diluir y en diluciones factor de 10 se utilizó para inmunizar a los ratones con
diferentes esquemas de inoculación. Los sueros y líquidos ascíticos
presentaron títulos de anticuerpos específicos entre 64 y 256, por la inhibición
de hemaglutinación (HAI) y IFI, mientras que los títulos por ELISA estuvieron
entre 6400 y 204800, para las mismas muestras. Para el virus MHV la Semilla
Maestra y la Semilla de Trabajo se obtuvo por inoculación del virus en
monocapas de células L929. Diluciones factor 10 de la cepa viral MHV se
utilizó para inmunizar a los ratones con diferentes esquemas de inoculación.
Los sueros y líquidos ascíticos presentaron títulos de anticuerpos específicos
entre 32 y 2048 por IFI, mientras que los títulos por ELISA estuvieron entre
3200 y 12800 para los sueros y entre 200 y 6400 para los líquidos ascíticos,
para las mismas muestras. Para el virus MVM la Semilla Maestra y la Semilla
de Trabajo se obtuvo por inoculación del virus en monocapas de células L929.
Diluciones factor 10 de la cepa viral MVM y de la ST viral se utilizó para
inmunizar a los ratones con diferentes esquemas de inoculación. Los sueros y
líquidos ascíticos se presentaron títulos de anticuerpos específicos entre 32 y
128 por inmunofluorescencia indirecta (IFI), mientras que los títulos por ELISA
estuvieron entre 1600 y 6400 para los sueros y entre 200 y 800 para los
líquidos ascíticos, para las mismas muestras. El antígeno para la pruebas IFI consistió en células enteras, mientras que para las pruebas de ELISA fue células lisadas por sonicación. Para el virus
Sendai ambos antígenos se obtuvieron por inoculación de 0,1 UHA de la ST en
células LLCMK2 y se cosechó el día 7pi. Para el virus MHV se inoculó ~105
DICT 50 / mL y para el virus MVM ~10 6DICT 50 / mL, en células L929. Las
células fueron procesadas el día 5 y 1 pi respectivamente. Nuestros estudios
muestran que el desarrollo de las pruebas de IFI y ELISA, (complementadas
con la prueba clásica de HAI para el caso del virus Sendai), comprenden una
batería de pruebas innovadoras y confiables para la detección de anticuerpos
contra los virus de Sendai, MHV y MVM en bioteros. Los resultados
presentados revelan que las metodologías desarrolladas en nuestro laboratorio
son herramientas eficaces para el control de la contaminación por los agentes
virales estudiados en colonias de ratones libres de patógenos específicos. Los
estudios presentados podrían considerarse como un punto de partida para el
desarrollo de futuros avances en este campo del conocimiento.
Palabras claves: ratones SPF, virus contaminantes de roedores , enzimo
inmuno análisis (ELISA), inmunofluorescencia indirecta (IFI) / It is widely known that the reliability of a mouse breeding colony for a
given experiment only can be demonstrated by a comprehensive health
monitoring of the animals before and during the experiment. We recommend
finding specific antibodies as indicators of virus circulation in the colony. In this
work, we developed the techniques of indirect immunofluorescence (IFI) and
enzyme immunoassay (ELISA) for the detection of antibodies to Sendai virus,
MHV virus and MVM virus in mouse breeding colonies. It was studied the
kinetics for each virus replication by harvesting cells and its respective
supernatants at different days post inoculation (pi). It was generated both a
master sample and a working sample by inoculation of Sendai virus in
embryonated chicken eggs. The working sample undiluted and 10-fold serial
dilutions were used to immunize mice following different schemes of inoculation.
Serum and ascitic fluid samples were collected and showed titers of specific
antibodies between 64 and 256, by hemaglutination inhibition (HAI) and IFI,
whereas serum and ascitic fluid samples showed titers between 6400 and
204800, by ELISA. The master sample for MHV virus and Working sample was
obtained by inoculation of the virus in L929 cell monolayers. The MHV virus 10-
fold serial dilutions were used to immunize mice following different schemes of
inoculation. Serum and ascitic fluids samples were collected and specific
antibody titers between 32 and 2048 by IFI, while ELISA titers were between
3200 and 12800 for the serum and 200 to 6400 for ascitic fluids samples, for the
same samples. The master sample for MVM virus and Working sample was
obtained by inoculation of the virus in L929 cell monolayers. The working
sample and 10-fold serial dilutions of MVM virus were used to immunize mice
following different schemes of inoculation.Serum and ascitic fluids samples
were collected and specific antibody titers between 32 and 128 by indirect IFI,
while ELISA titers were between 1600 and 6400 for serum and 200 to 800 for
ascites fluids samples, for same samples. The antigen for IFA tests consisted of
whole cells, while for the ELISA was lysed cells by sonication. Sendai virus for
both antigens was obtained on day 7pi in LLCMK2 cells by inoculation of 0.1
UHA of working sample. For MVM virus was inoculated ~10 6DICT 50 / mL and
MHV was inoculated ~105 DICT 50 / mL. They were processed L929 cells and
used on day 1 and 5pi respectively. Our results show that the development of
specific IFI and ELISA, (complemented by the classical test of HAI for Sendai
virus), comprise a battery of innovative and reliable tests for the detection of
antibodies against Sendai virus, MHV virus and MVM virus in laboratory mice.
These initial data reveal that both tests might be efficient tools for the monitoring
of contamination by these viral agents in colonies of specific pathogen free
mice. The studies presented could be considered as a starting point for the
development of future advances in this field of knowledge.
Keywords: specific pathogen free mice, rodent virus contaminantion, enzyme
immunoassay (ELISA), immunoflurescence assay (IFI)
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/2434 |
| Date | 03 March 2013 |
| Creators | Maiza, Andrea Soledad |
| Contributors | Ambrosio, Ana María, Roque, Marta Elena |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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