O fenômeno de amplificação gênica é um mecanismo de auto-preservação celular observado com freqüência no protozoário parasita Leishmania quando submetido a estímulos negativos como, por exemplo, a presença de drogas. A região H do genoma de Leishmania (Leishmania) major é um dos loci mais estudados que leva à amplificação em resposta a drogas não relacionadas, como a terbinafina. Foram isoladas linhagens de L. (L.) major e Leishmania (Viannia) braziliensis resistentes à terbinafina. Análises por corridas curtas de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e Southern blotting revelaram que a resistência observada nestas linhagens não foi gerada pela amplificação do locus H. Sendo assim, a resistência ao inibidor da esqualeno epoxidase está sendo gerada por um outro mecanismo uma vez que outros loci podem estar envolvidos na resistência à terbinafina e através da análise diferencial do perfil de proteínas, os mutantes resistentes apresentaram diferenças na expressão de proteínas. O alvo inicial para a elucidação da resistência à terbinafina nas linhagens selecionadas foi a via de biossíntese de ergosterol. Foram escolhidos os genes da 3-cetoacil-CoA tiolase (ERG10), esqualeno sintase (ERG9 ou SQS1), esqualeno epoxidase (ERG1), oxidoesqualeno-lanosterol ciclase (ERG7) e lanosterol 14-demetilase (ERG11), de L. major e L. braziliensis, além do gene YIP1 de L. braziliensis. Para isso foram sintetizados oligonucleotídeos a partir das seqüências geradas pelo projeto genoma destas espécies depositadas em bancos de dados. Os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 de L. major e de L. braziliensis além do YIP1 de L. braziliensis amplificados por PCR foram clonados no vetor pGEM-T Easy, que possibilitou a construção de reagentes para ruptura de todos genes pela inserção da marca HYG e, com exceção do gene ERG7 de L. braziliensis, os genes foram subclonados no vetor pXG1. Fragmentos de restrição dos genes clonados no vetor pGEM-T Easy foram utilizados para analisar o nível de seus transcritos por northern blot. Também verificamos através de corridas curtas de PFGE e análises de Southern, que as linhagens em estudo não apresentam amplificação dos loci em estudo. A participação de genes da via de biossíntese de ergosterol de L. major e L. braziliensis e do gene YIP1 de L. braziliensis na resistência ou susceptibilidade à terbinafina e/ou anfotericina B foi verificada através de experimentos funcionais. Com esse objetivo, os genes YIP1, ERG10 e ERG1 de L. braziliensis foram transfectados na linhagem LB2904 de L. braziliensis, e os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 e a ruptura do gene ERG1 pelo cassete HYG de L. major foram transfectados na linhagem LT252 de L. major. Foram realizados experimentos para analisar a susceptibilidade à anfotericina B associada ou não à terbinafina, das linhagens selvagens de L. major e L. braziliensis, e a partir destes experimentos iniciais, foram selecionadas linhagens destas duas espécies resistentes à anfotericina B. Para analisar a possível função regulatória dos elementos RIME 5/2/6 de L. braziliensis, foi feita a amplificação por PCR da repetição invertida LbRIME 5/2/6b que permitiu a clonagem deste fragmento no vetor pGEM-T Easy e a sua ruptura pela marca SAT. A clonagem no vetor pGEM possibilitou a análise da interação de proteínas nucleares à repetição LbRIME 5/2/6b através do gel shift. / Gene amplification is a common phenomenon observed in Leishmania cell lines subjected to drug pressure. The H locus of Leishmania (Leishmania) major is normally found amplified in cell lines selected in unrelated drugs, as terbinafine. We selected cell lines of L. (L.) major and Leishmania (Viannia) braziliensis resistant to terbinafine. Short-run Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Southern blotting analysis showed that this resistance was not generated by H locus amplification. Resistance to squalene epoxidase inhibiter is being generated by other mechanism once others loci can be involved in the terbinafine resistance and through protein partner differential analysis, mutants resistant showed differences in protein expression. The initial target to terbinafine resistance elucidation in the cell lines selected was ergosterol biosynthesis pathway. We choose genes: 3-ketoacyl-CoA thiolase (ERG10), squalene synthase (ERG9 or SQS1), squalene epoxidase (ERG1), oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7), and lanosterol 14-demethylase (ERG11), of L. major and L. braziliensis, besides YIP1 gene of L. braziliensis. For this, primers were synthesized using the sequences generated by genome project of these species inserted in gene bank. The genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 and ERG11 of L. major and of L. braziliensis besides YIP1 of L. braziliensis were amplified by PCR and cloned into pGEM-T Easy vector that enabled all genes disruption by insertion of HYG cassette and, with exception of the ERG7 gene of L. braziliensis, genes were subcloned into shuttle-vector pXG1. Restrictions fragments of these genes were used in Northern analysis to verify the transcripts level. We verified through short-run PFGE and Southern analysis that the resistant cell lines do not show amplification of studied loci. The participation of ergosterol biosynthesis pathway genes of L. major and L. braziliensis and YIP1 gene of L. braziliensis in the resistance to terbinafine was verified in functional experiments. With this objective, the genes YIP1, ERG10 and ERG1 of L. braziliensis were transfected into LB2904 cell line of L. braziliensis, and the genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 and ERG11 and the ERG1 gene disruption by HYG mark of L. major were transfected into LT252 cell line of L. major. Experiments that analyze the susceptibility to amphotericin B associated or not to terbinafine were performed using the wild type cell lines of L. major and L. braziliensis, and with this initials experiments, we selected cell lines of these two species resistant to amphotericin B. In order to analyze the possible regulatory function of the RIME 5/2/6 elements of L. braziliensis, the repeat LbRIME 5/2/6b was amplified by PCR and cloned into pGEM-T Easy vector and with this clone, the element was disrupted with a SAT cassette. The cloning into vector pGEM enabled to analyze the interaction of the nuclear protein with the repeat LbRIME 5/2/6b through gel shift assay.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06052009-093740 |
| Date | 24 November 2008 |
| Creators | Dias, Fabrício César |
| Contributors | Tosi, Luiz Ricardo Orsini |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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