O escorpião Tityus serrulatus (Ts) é o responsável pela maioria casos de envenenamento escorpiônicos do Brasil. Embora sua peçonha seja constituída de inúmeros componentes, as neurotoxinas apresentam maior relevância por interagirem especificamente com canais para sódio (Nav) ou potássio (Kv) dependentes de voltagem. Até o momento, já foram descritas 20 neurotoxinas (Ts1 -> Ts20) na peçonha do Ts. No entanto, através de análises ômicas, estima-se que este número seja bem superior. Toxinas que interagem seletivamente com canais iônicos são utilizadas como ferramentas farmacológicas, pois permitem a identificação de canais específicos e a determinação de seus papéis fisiológicos. Adicionalmente, estas toxinas podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novos medicamentos para tratar doenças relacionadas a canais iônicos. Considerando o elevado potencial biotecnológicos desta classe de moléculas, o presente trabalho isolou (através de 3 etapas cromatográficas) e caracterizou uma nova toxina da peçonha de Ts, denominada Ts19 Frag-II. A nova toxina demonstrou possuir 49 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 5534,54012 Da. Classificada como ?-KTx, especula-se que a Ts19 Frag-II seja produzida a partir de uma modificação pós-transducional, denominada neste estudo de post-splitting, de um transcrito da Ts19. A caracterização funcional da Ts19 Frag-II foi realizada utilizando diferentes ensaios de atividade biológica. Uma extensa avaliação eletrofisiológica em canais iônicos (16 Kvs e 5 Navs) expressos em oócitos de X. leavis demonstrou que a toxina é capaz de bloquear seletivamente canais para potássio do tipo Kv1.2 (IC50 = 544 ± 32 nM). Ensaios in vivo (camundongos C57BL/6) de dor revelaram que a Ts19 Frag-II (2 e 4?g) não é capaz de induzir comportamento nociceptivo espontâneo ou mecânico em camundongos, tanto pela administração intraplantar quanto pela via intratecal. Ensaios in vivo (camundongos BALB/c) também demonstraram que a nova toxina (4 e 8?g) induz aumento dos níveis séricos de ureia, ALT, ?-globulina, IL-6, TNF-?, IL-17A e NO, além de diminuir a quantidade de ?-globulinas. Adicionalmente, utilizando ensaios in vitro de cultura celular de linfócitos T CD4+, demonstrou-se que a Ts19 Frag-II (2 ?g) foi capaz de diminuir a diferenciação de células Th17, assim como suprimir sua função (diminuiu a produção de IL-17 e IL-22). Assim, no presente estudo foi realizado o isolamento e a caracterização molecular e funcional de uma nova toxina de Ts, a qual apresentou atividade neurotóxica e pró-inflamatória, podendo contribuir significativamente para a gravidade do quadro de envenenamento ocasionado pelo escorpião Ts. Adicionalmente, sua seletividade para canais Kv1.2 faz com que Ts19 Frag-II possa ser utilizada como ferramenta de estudo deste canal iônico / The scorpion Tityus serrulatus (Ts) is responsible for most cases of scorpion envenomations in Brazil. Although its venom consist of many components, neurotoxins present major relevance because their specific interaction with voltage-gated sodium (Nav) or potassium (Kv) channels. So far, 20 neurotoxins have been described (Ts1 -> Ts20) in the Ts venom. However, omics analysis indicate that this number is much higher. Toxins that interact selectively with ion channels are used as pharmacological tools, as they allow the identification of specific channels and the determination of their physiological roles. Additionally, these toxins may be used for the development of new drugs for treating disorders related to ion channels. Considering the high biotechnology potential of this class of molecules, this study isolated (by 3 chromatographic steps) and characterized a new toxin from Ts venom, named Ts19 Frag-II. The novel toxin presented 49 amino acid residues and a molecular mass of 5534.54012 Da. Classified as ? - KTx, it is speculated that the Ts19 Frag-II is produced from a post- translational modification, referred in this study as post- splitting, a transcript of Ts19. The functional characterization of Ts19 Frag-II was performed using different biological assays. The extensive electrophysiological study on ion channels (16 Kvs and 5 Navs) expressed in oocytes of X. leavis showed that the toxin is able to selectively block the potassium channel Kv1.2 (IC50 = 544 ± 32 nM). In vivo assays (C57BL/6 mice) of nociception showed that Ts19 Frag-II (2 and 4?g) is not able to induce spontaneous or mechanical nociceptive behavior in mice, both by intraplantar as by intrathecal administration. In vivo assays (BALB/c mice) also demonstrated that the novel toxin (4 and 8?g) increased serum levels of urea, ALT, ?-globulin, IL-6, TNF-?, IL-17A and NO, besides decreasing ?-globulins. In addition, using in vitro assays of CD4+ T-lymphocyte cell culture, it was demonstrated that Ts19 Frag-II (2 ug) was able to decrease the differentiation of Th17 cells, as well as it suppresses Th17 function (decreased IL-17 and IL-22 production). Therefore, the present study isolated and performed the molecular and functional characterization of a new toxin from Ts, which presented neurotoxic and pro-inflammatory activity and could contribute significantly to the severity of the envenoming caused by the Ts scorpion. Moreover, based on its selectivity for Kv1.2 channels, this toxin could be used as a tool to study this type of ion channel
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03052017-161415 |
| Date | 16 December 2016 |
| Creators | Cerni, Felipe Augusto |
| Contributors | Braga, Eliane Candiani Arantes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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