Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2017-05-20T13:22:39Z
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Previous issue date: 2017-05-20 / O interesse na caracterização de novos inibidores de peptidases (PIs) tem
aumentado nas últimas décadas devido a seu potencial uso na prevenção e tratamento de
diversas doenças humanas. Muitos PIs já foram caracterizados de animais venenosos e
peçonhentos, como anêmonas, serpentes, anuros e, mais recentemente, escorpiões e
aranhas. Nesse estudo apresentamos uma nova classe de inibidor de serinopeptidase
isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus (Buthidae), responsável por muitos casos de envenenamento na região Amazônica. Denominado ToPI1, ele foi purificado da peçonha bruta por RP-HPLC, e sua sequência foi determinada por MALDI-ISD e pela análise de seu precursor, obtido da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha do T. obscurus. O ToPI1 compartilha menos de 45% de similaridade com outros peptídeos descritos em bancos de dados públicos. Ainda assim, todas eles são bloqueadores ou possíveis bloqueadores de canais de K+, não havendo similaridade com nenhum PI descrito até o momento. O peptídeo sintético oxidado (ToPI1s), obtido usando a estratégia Fmoc/t-butila, foi ativo contra tripsina em ensaios cromogênicos, mostrando-se do tipo tight-binding, e também por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), em um biossensor Biacore 3000, onde apresentou afinidade picomolar por tripsina imobilizada. Os resultados indicaram que a
formação do complexo ToPI1:tripsina é espontânea, endotérmica e favorecida por um
aumento de entropia. Experimentos em SPR indicaram que o ToPI1s se liga ao sítio ativo da tripsina, semelhante aos inibidores canônicos. O ToPI1s não inibiu quimotripsina mesmo em concentrações elevadas. Também não reduziu a viabilidade de células tumorais HeLa (de câncer cervical humano) e B16F10 (de melanoma murino) nem de fibroblastos murinos não tumorais (NIH-3T3). Seu efeito foi mínimo ou nulo nas correntes de diferentes subtipos de canais de K+. O ToPI1s não causou alterações comportamentais e/ou fisiológicas visíveis em camundongos. A potente atividade inibidora de tripsina do ToPI1s em conjunto com esses resultados negativos o tornam um candidato atrativo para futuras aplicações terapêuticas. Análises por dicroísmo circular (190-260 nm) sugerem ausência de diferenças de estrutura secundária entre o ToPI1 nativo e o ToPI1s, com predominância de estruturas do tipo β (folhas-β e voltas-β) e desordenadas, e menor quantidade de α-hélice. O ToPI1s mostrou-se bastante estável, não desnaturando na faixa de pH 3,0-9,0 mesmo a 95°C. Dois análogos do ToPI1 foram sintetizados, os quais estão sob processo de proteção à propriedade intelectual. / The interest in the characterization of new peptidase inhibitors (PIs) has increased
in recent decades due to their potential use in the prevention and treatment of several
human diseases. Many PIs from poisonous and venomous animals such as sea anemones,
snakes, anurans and, more recently, scorpions and spiders have been characterized. In the
present study we present a new class of serinopeptidase inhibitor isolated from Tityus
obscurus scorpion venom. This species (Buthidae) is responsible for many cases of
envenomation in the Amazon region.
Named ToPI1, it was purified from the crude venom by RP-HPLC and its sequence
was determined by MALDI-ISD and by the analysis of its precursor, obtained from the cDNA
library of T. obscurus venom gland. ToPI1 shares less than 45% sequence similarity with
other peptides described in public databases. Still, they are all blockers or potential
blockers of K+ channels, with no similarity to any PI described so far. The oxidized synthetic
peptide (ToPI1s), obtained by using the Fmoc/t-butyl strategy, was active against trypsin in
chromogenic assays, displaying tight-binding inhibition, and also by Surface Plasmon
Resonance (SPR) in a Biacore 3000 biosensor, where it showed picomolar affinity to
immobilized trypsin. The results indicated that the formation of the bimolecular complex
ToPI1:trypsin is spontaneous, endothermic and favored by an entropy increase.
SPR experiments indicated that ToPI1s binds to the active site of trypsin, similar to
the canonical inhibitors. ToPI1s did not inhibit chymotrypsin even at high doses. In addition,
it reduced neither the viability of the tumor cells HeLa (from human cervical cancer) and
B16F10 (from murine melanoma) nor of non-tumor murine fibroblasts (NIH-3T3). It showed
minimal or null effect on the currents of different subtypes of K+ channels. The ToPI1s did
not cause any visible behavioral and/or physiological changes in mice. The potent trypsin
inhibitory activity of ToPI1s together with these negative results make it an attractive
candidate for future therapeutic purposes. Analysis by circular dichroism (190-260 nm)
suggests the absence of differences in secondary structures between ToPI1s and the native
ToPI1, with predominance of β-type structures (β-sheets and β-turns) and randon coil, and
a smaller amount of α-helix. The ToPI1s proved to be very stable, non-denaturing at the
range of pH 3.0 to 9.0 even at 95 °C. Two ToPI1 analogues were synthesized, which are
under process of intellectual property protection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/23544 |
| Date | 15 March 2016 |
| Creators | Mourão, Caroline Barbosa Farias |
| Contributors | Schwartz, Elisabeth Nogueira Ferroni |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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