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Previous issue date: 2011 / Classical parasitological methods are not sensitive enough to detect most of the infected individuals in low intensity transmission areas like in Esteio, Rio Grande do Sul. To optimize methods for detection of eggs in feces, when they are rare events, the estrategy was to examine large amounts of feces. A novel diagnostic method for isolation of Schistosoma mansoni eggs in feces, and an initial evaluation of its performance is now reported Helmintex. Is a concentration method with sequential steps of spontaneous sedimentation, sieving, ether-acetate centrifugation method (Ritchie) and a final step where eggs are isolated through interaction with paramagnetic beads in a magnetic field, and the sediments retained at the wall are collected and examined under a microscope. The objective of the second part of the investigation was to evaluate TaqMan Real Time PCR as an alternative for microscopic analysis as the detection procedure for final sediment resulting from Helmintex. To evaluate the new concentration method, S. mansoni eggs were added to 30 grams of normal feces to produce suspensions ranging from 0. 1 to 1. 34 eggs per gram of feces (epg) and the feces were submitted to all steps of concentration method. All the sediment was analysed by light microscopy and at least 1 egg was found in 20% (0. 1 epg); 50% (0. 24); 50% (0. 34); 60% (0. 67); 80% (1. 0) and 100% (1. 34) of the seeding experiments. For evaluation of the TaqMan Real Time PCR as an alternative for detection of eggs in feces after the concentration Helmintex method, primers and probe targeting the cytocromo-C oxidase subunit 1 gene were designed for amplification S. mansoni specific DNA. Four procedures for DNA extraction were evaluated. Suspensions in distilled water and feces were prepared containing 1, 10, 20, 40 and 80 eggs. S. mansoni DNA was extracted from 1000 eggs for determination of a standard curve to estimate the DNA concentration and determine the limits of the detection. DNA was amplified from all the spiked egg suspensions, including the samples with only 1 egg. Illustra Tissue and Cell GenomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare) presented the best extraction performance. The standard curve for DNA concentration from 1000 eggs had a detection limit at 1 pg but with 13. 8 % of the reproductibility and 100 pg at 100 % of reproductibility. The novel S. mansoni detection method, named Helmintex may significantly improve diagnosis of infections with low intensity of infection, with two alternatives for the detection step: microscopic analysis and Real Time PCR Improved diagnostic methods are a main stem in the current worldwide efforts to reduce morbidity of schistosomiasis and its dissemination. / Em focos de introdução recente da esquistossomíse, como Esteio na região metropolitana de Porto Alegre, a parasitose ocorre com baixas prevalências e cargas parasitárias, resultando em dificuldades para o diagnóstico parasitológico, em virtude da sensibilidade inadequada dos métodos clássicos. O principal objetivo deste trabalho foi otimizar o desempenho de métodos de diagnóstico, em situações que os ovos nas fezes são um evento raro. A estratégia foi examinar grandes quantidades de fezes, o que resultou na descrição e avaliação de um novo método de diagnóstico para detecção de ovos de Schistosoma mansoni nas fezes denominado Helmintex. Este é um método de concentração, onde as fezes passam por uma sequência de sedimentação espontânea, tamisagem, centrifugação com acetato de etila (Ritchie) e uma etapa final onde os ovos são isolados através de interação com partículas paramagnéticas em um campo magnético. Após a concentração, na etapa de detecção dos ovos todo o sedimento resultante é analisado através de microscopia óptica. Na segunda etapa deste trabalho o objetivo foi avaliar o desempenho da PCR em tempo real (tecnologia Taqman) como alternativa de método de detecção no sedimento final do Helmintex, substituindo a análise microscópica. Para realização da primeira etapa, ovos de S. mansoni foram adicionados em 30 g de fezes negativas para a infecção, formando suspensões de 0,1 a 1,34 ovos por grama de fezes (opg), e as fezes foram submetidas a todas as etapas de concentração do método. Para cada suspensão testada foi encontrado pelo menos 1 ovo em 20% (0. 1 opg); 50% (0. 24); 50% (0. 34); 60% (0. 67); 80% (1. 0) e 100% (1. 34) das tentativas testadas para cada suspensão. Para a avaliação do desempenho da PCR,"primers" e sonda para o gene da citocromo-C oxidase subunidade 1 foram desenhados para a amplificação do DNA de S. mansoni. Para a extração do DNA foram avaliados 4 protocolos diferentes. Foram preparadas suspensões de ovos em água destilada e fezes, contendo 1, 10, 20, 40 e 80 ovos. E amostras de 1000 ovos foram extraídas para a construção de uma curva padrão da estimativa de concentração de DNA, para verificação do limite de detecção da reação. A amplificação do DNA do parasito pode ser vista em todas as suspensões testadas, inclusive a que continha 1 ovo. Dos 4 protocolos de extração avaliados, o Illustra Tissue and Cell GenomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare), um kit de extração comercial, foi o que apresentou o melhor rendimento. A curva padrão construída a partir de 1000 ovos apresentou um limite de detecção de 1 pg com reprodutibilidade de 13,8%. Considerando 100% de reprodutibilidade, a reação apresentou limite de detecção de 100 pg. O novo método Helmintex descrito neste trabalho representa grande avanço no diagnóstico da esquistossomíse em infecções com baixas cargas parasitárias, além disso, apresentam-se 2 opções de métodos de detecção (visualização microscópica e amplificação de DNA dos ovos pela PCR em tempo real). Estes avanços contribuem para o esforço em curso de reduzir mundialmente a morbidade e a disseminação das áreas de transmissão das esquistossomíases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_PUC_RS:oai:meriva.pucrs.br:10923/1394 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Teixeira, Candida Fagundes |
| Contributors | Graeff-Teixeira, Carlos |
| Publisher | Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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