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Previous issue date: 2014-02-26 / FACEPE / A interação de moléculas unitárias com nanoporos individuais é relevante em diversos processos biológicos, químicos e físicos, uma vez que pode proporcionar o desenvolvimento de dispositivos analíticos, dentre os quais, podemos destacar: sensores, biossensores, espectrômetros de massa e sequenciadores moleculares. Nesse contexto, o nanoporo formado pela α-hemolisina (α-HL) de Staphylococcus aureus é de especial interesse no desenvolvimento de dispositivos sensores devido às suas características estruturais e funcionais. Várias estratégias são utilizadas para melhorar a sua capacidade de detecção pelo uso de adaptadores moleculares ou pela modificação química do nanoporo. O diferencial deste trabalho deve-se a modificação das condições físicos-químicas da solução banhante do elemento de reconhecimento molecular ou seja, o nanoporo unitário. Os íons em meio aquoso podem causar efeitos específicos conhecidos como efeitos de Hofmeister. De acordo com a sua atuação na estrutura da água, os íons podem ser classificados como cosmotrópicos ou caotrópicos. A mudança da estrutura da água por sua vez é capaz de influenciar na solubilidade e estrutura dos co-solutos. Igualmente a composição iônica da solução pode alterar a interação das moléculas solubilizadas. Deste modo neste estudo investigamos os efeitos específicos induzidos pelos cátions e ânions da Série de Hofmeister na interação de moléculas unitárias orgânicas com nanoporos proteicos individuais. A confecção da bicamada lipídica plana e a inserção do nanoporo unitário na membrana, bem como os registros de correntes iônicas através dos poros foram obtidos em condições de fixação de voltagem. Na solução banhante do nanoporo utilizou-se os ânions da família VIIA, formando sais com o K⁺, ou, os cátions da família IA e o íon amônio, formando sais com o Cl⁻, todos na concentração de 4M. A interação da molécula unitária (analito) com o nanoporo causa um bloqueio característico na corrente iônica que passa através dele. A análise desses eventos permite determinar as constantes cinéticas da interação analito-nanoporo. Avaliando a influência do íon amônio e dos íons da família IA e VIIA na interação do analito (polietilenoglicol 1294; PEG 1294) com o nanoporo observamos que esta é muito dependente do tipo do sal. Todos os íons utilizados nesse trabalho induziram efeitos específicos em sistema confinado. Com relação à influência na constante de associação, todos os ânions seguiram a típica série de Hofmeister: F⁻ > Cl⁻ > Br⁻ > I⁻. Já para a constante de dissociação e a solubilidade do PEG, encontramos uma sequência de Hofmeister inversa: F⁻ < Cl⁻ < B⁻ < I⁻. Ao contrário do observado com os ânions, a influência dos cátions sobre as constantes de interação não seguiu a série de Hofmeister. Para a constante de associação, obtivemos a seguinte sequência: Cs⁺ > K⁺ ≥ Rb⁺> Na⁺ > NH⁺ > Li⁺. Para a constante de dissociação obtivemos: K⁺ < Rb⁺ < Cs⁺ < Na⁺ < NH₄⁺ < Li⁺. Uma forte correlação entre as mudanças das constantes cinéticas e a solubilidade do PEG também foi estabelecida. Demonstramos que o efeito salting-out é o responsável por mudanças estabelecidas na interação do analito com o nanoporo. Adicionalmente as constantes de interação PEG/nanoporo são dependentes do potencial transmembrana indicando que o polímero não iônico (PEG) atua como uma molécula com carga elétrica em meio aquoso iônico. Estabelecemos também que a sensibilidade do sensor ao PEG depende fortemente do tipo de íon presente na solução banhante do nanoporo. / The interaction of single molecules with single nanopores is important in several biological, chemical and physical processes because it can provide the development of analytical devices, such as sensors, biosensors, mass spectrometers and molecular sequencers. In this context, the nanopore formed by α-hemolysin (α-HL) of Staphylococcus aureus is very studied for the development of sensor devices due to their structural and functional characteristics. Several strategies are adopted to improve its detection ability, such as the use of molecular adapters and chemical modification of the nanopore. In this work, our approach is different, we modify the ionic composition of the bath solution of the nanopore protein. Ions in aqueous environment can cause specific effects known as Hofmeister effects. According to their influence on the structure of water, the ions can be classified as kosmotropic and chaotropic. The change in the structure of water in turn can influence the structure and solubility of the co- solutes. Then the ionic composition of the solution may change the interaction of solubilized molecules. The goal of this study was to investigate the specific effects induced by cations and anions from Hofmeister series on the interaction of single molecules with nanopores. The preparation of planar lipid bilayer, and single nanopore insertion into membrane, and records of ionic currents were conducted in conditions of voltage clamp. In the bath solution, we use the anions from group VIIA, forming salts with K⁺, and cations from group IA plus ammonium ion, forming salts with Cl⁻ at 4M concentration. The interaction of the analyte with the nanopore causes a blocking characteristic in ionic current through the pore protein. The analysis of these molecular events permit to determine the kinetic constants of the analyte-nanopore interaction. The influence of the anions and cations here investigated in interaction of the analyte (polyethylene glycol 1294, PEG 1294 ) with the nanopore is very dependent on the type of salt. All ions used in this study induced specific effects in confined spaces. With regard to the influence on the on-rate constant, all anions followed the typical Hofmeister series: F⁻ > Cl⁻ > Br⁻ > I⁻. For the off-rate constant and solubility of PEG, we found an inverse Hofmeister sequence: F⁻ < Cl⁻ < Br⁻ < I⁻. However, the influence of the cations on the rate constants didn’t follow the Hofmeister series. For the on-rate constant, we obtained the following sequence: Cs⁺ > K⁺ ≥ Rb⁺ > Na⁺ > NH⁺ > L⁺. For the off-rate constant, we obtained : K⁺ < Rb⁺ < Cs⁺ < Na⁺ < NH₄⁺ < Li⁺. Strong correlation between the changes of the rate constants and the PEG solubility was established. We suggest that the salting-out effect is responsible for the changes on the interaction analyte/ nanopore. Additionally, we found that the rate constants are dependent on voltage transmembrane indicating that the non-ionic polymer (PEG) acts as a molecule with electric charge in an aqueous environment. We also established that the sensitivity of the nanopore it was strongly dependent on the type of ion present in the bath solution. So, the choice of the optimal electrolyte is an important step to stochastic sensors based on a single nanopore.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/26561 |
| Date | 26 February 2014 |
| Creators | MACHADO, Dijanah Cota |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/8006395717703055, http://lattes.cnpq.br/3549072305661571, FONTES, Adriana, KRASILNIKOV, Oleg Vladimirovich, RODRIGUES, Cláudio Gabriel |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
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