El biodiesel se obtiene a nivel industrial, casi en su totalidad, a partir de aceites
de semillas. Sin embargo, el incremento de la demanda energética, el uso del
agua dulce y la utilización de semillas con fines alimenticios plantean la
necesidad y búsqueda de nuevas fuentes de materias primas sustentables que,
además, posean impactos mínimos sobre el medio ambiente. Muchas especies
de microalgas, denominadas oleaginosas, han despertado gran interés como
fuente potencial de lípidos neutros (LN), específicamente triglicéridos (TAG),
considerados la materia prima ideal para la producción de biodiesel. Una
posible estrategia para mejorar los costos de producción del biodiesel de
tercera generación es la búsqueda y selección de especies nativas de
microalgas que, además de producir TAG, sean capaces de sintetizar
productos de alto valor agregado.
Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo general de esta tesis fue
evaluar el potencial de una especie de diatomea nativa del Estuario de Bahía
Blanca como materia prima para la producción de biodiesel y sustancias
poliméricas extracelulares como co-productos de valor agregado, bajo un
concepto de biorrefinería. Los objetivos específicos planteados fueron: 1) la
identificación de la especie; 2) la optimización de técnicas para la
determinación de la densidad celular, la concentración de pigmentos
fotosintéticos y el contenido de lípidos neutros en cultivos a escala de
laboratorio; 3) analizar el efecto de distintas condiciones ambientales
(temperatura [15ºC y 20ºC], medios de cultivo [f/2, SWES, y SWES-N] y la fase
estacionaria sobre parámetros de crecimiento, producción de biomasa,
cantidad y calidad de lípidos y productividad lipídica con especial énfasis en la
fracción de lípidos neutros; 4) evaluar el potencial de las sustancias poliméricas
extracelulares liberadas por N. cincta como co-producto de valor; y 5) analizar
el crecimiento de la especie en un fotobiorreactor columnar de 25L.
Los estudios morfológicos con microscopios óptico y electrónico de barrido
permitieron identificar a la especie en estudio como Navicula cincta, una
diatomea pennada. La cepa fue depositada en el Culture Collection of
Autotrophic Organism (CCALA), República Checa, bajo la denominación
Navicula cincta CCALA 984.
La velocidad de crecimiento de N. cincta varió entre 0,29 div. día-1 y 1,42 div.
día-1, mientras que el tiempo de generación varió entre 16,8 horas y 82,5 horas.
Las máximas densidades celulares (DC) fueron obtenidas con el medio SWESN.
Se estableció un modelo entre la DC y la absorbancia, el cual permitió
monitorear el crecimiento de N. cincta en f/2. La espectrofluorometría de la
clorofila a se presentó como un método adecuado para evaluar la cinética de
crecimiento y para obtener información sobre el estado fisiológico de los
cultivos. La cinética de clorofila a in vivo presentó la misma dinámica que la de
la DC en los tres medios de cultivo testeados. El medio f/2 resultó adecuado
para producir un rápido crecimiento seguido de una fase estacionaria
temprana, mientras que los medios SWES y SWES-N permitieron un
crecimiento sostenido a lo largo de todo el período considerado. La relación
IFR-Cel establecida entre la intensidad de fluorescencia relativa del cultivo
teñido con Rojo Nilo (IFR-RN) y la DC se propone como un índice para estimar
el tiempo de acumulación máxima de LN y, por lo tanto, determinar el tiempo
de cosecha de la biomasa. Esta información resultó útil para cultivos llevados a
cabo en medio f/2, pero no así en los desarrollados en los medios SWES y
SWES-N, debido a que en éstos últimos no se detectó acumulación lipídica.
El contenido de lípidos totales (LT) de N. cincta varió entre 6-40 % del peso
seco libre de cenizas (% PSLC). En las condiciones de crecimiento evaluadas,
los LN o TAG representaron entre un 50 % y 90% de los LT. La mayor
productividad de LN fue de 10 mg. L-1. d-1 en los cultivos creciendo a 20°C en
f/2 durante 10 días. Los valores más bajos de LT y LN se obtuvieron con los
medios SWES y SWES-N, sugiriendo que en estos medios no hubo
acumulación lipídica. Con respecto a la composición de los LN, los ácidos
grasos monoinsaturados (AGMI) fueron la clase dominante representando el
53% a 60%, seguida por los ácidos grasos saturados (AGS) que constituyeron
entre el 22% a 28%. Una excepción a este patrón ocurrió en los cultivos en
SWES-N, donde los contenidos de AGMI y AGS de la fracción neutra fueron
similares (39% y 38%, respectivamente). Los ácidos grasos poliinsaturados
(AGPI) fueron la fracción minoritaria en todos los casos testeados. El perfil de
ácidos grasos de la fracción neutra fue similar en todas las condiciones de
cultivo testeadas. Los principales ácidos grasos fueron los ácidos palmítico
(16:0), palmitoleico (16:1 (n-7)) y eicosapentaenoico (20:5 (n-3)). En relación a
los parámetros de calidad del aceite, el índice de Yodo y el contenido de ácido
linolénico estuvieron dentro de los límites establecidos por el estándar de
calidad europeo EN14214. Estas características permiten inferir que los aceites
de N. cincta se presentan como una materia prima adecuada para la
producción de biodiesel.
En las cinéticas de nutrientes se pudo observar una limitación de fósforo y
sílice en el medio f/2, durante la fase estacionaria. En los medios SWES y
SWES-N, los nutrientes no alcanzaron valores limitantes para el crecimiento, lo
cual se visualizó en un incremento sostenido en la DC y en la baja acumulación
de LN.
Las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de N. cincta fueron
clasificadas en EPS solubles (EPS-S), EPS levemente unidos a la célula (EPSLU)
y EPS fuertemente unidos (EPS-FU) a la célula. Las cinéticas de
producción de las mismas fueron analizadas en los tres medios de cultivo. Los
EPS-S fueron el principal constituyente en los medios f/2 y SWES (77% y 86%
de los EPS totales, respectivamente), mientras que en SWES-N representaron
la tercera parte del total de EPS. La producción media de los EPS-S estaría
relacionada con las relaciones estequiométricas N/P. En general, los EPS-FU
fueron más abundantes que los EPS-LU y esto podría estar asociado al hábito
bentónico de la especie. La composición de monosacáridos neutros de los
EPS-S fue similar a la de los EPS-FU. Sus principales componentes fueron
xilosa, manosa y N-acetilglucosamina. Los EPS-LU estuvieron mayormente
constituidos por galactosa y glucosa. La relación carbohidrato:proteína y la
identificación de la N-acetilglucosamina y la N-acetilgalactosamina sugieren la
presencia de proteoglucanos y/o glicoproteínas en los EPS.
Navicula cincta fue cultivada en un fotobiorreactor columnar con medio SWESN
y con CO2. Los cultivos presentaron una fase exponencial, estacionaria y una
de disminución celular, no detectada a escala de laboratorio. La producción de
biomasa fue de 319 mg. L-1. La cinética espectrofluorométrica del Rojo Nilo
evidenció acumulación de LN durante la fase estacionaria. El contenido de LT
fue de 32 % PSLC, representando los LN un 81 % de los LT. La productividad
de los LN fue de 51 mg. L-1.d-1. Con respecto a la composición de ácidos
grasos de los LN, el porcentaje de AGMI fue de 51%, mientras que los de AGS
y AGPI fueron de 32% y 16%, respectivamente. Los principales ácidos grasos
fueron los ácidos palmítico, palmitoleico y eicosapentaenoico.
De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede concluir que la microalga
oleaginosa Navicula cincta puede ser considerada como una especie
potencialmente útil para la producción de biodiesel. Además, la producción
simultánea de TAG para biodiesel y de EPS como co-producto, bajo un
contexto de biorrefinería, se presenta como una propuesta novedosa para ser
aplicada en cultivos energéticos sustentables. / Biodiesel is obtained at industrial level almost entirely from seed oils. However,
factors like increasing of the demand of energy, freshwater use and the
utilization of seeds for food purposes suggest the need and search for new
sources of sustainable and alternative feedstocks, which have minimal impacts
on the environment. Many species of microalgae, called oleaginous, have
raised great interest as a potential source of neutral lipids, specifically
triglycerides (TAG), which are considered the ideal feedstock for biodiesel
production. A possible strategy for improving the cost of production of thirdgeneration
biodiesel is the search and selection of microalgae native species
that can produce TAG and could be able to synthesize valuable co-products.
On the basis of previous background, the objective of this thesis was to
evaluate the potential of a native diatom from Bahía Blanca Estuary as raw
material for both biodiesel production and extracellular polymeric substances as
valuable co-products, under a concept of biorefinery. The specific objectives
were: 1) to identify the species; 2) to optimize different techniques for the
determination of cell density, the photosynthetic pigment concentration and the
content of neutral lipids in cultures at laboratory scale; 3) to analyse the effect of
different environmental conditions (temperature [15°C and 20°C], culture media
[f/2, SWES, SWES-N] and stationary phase) on growth parameters, biomass
production, lipid quantity and quality and lipid productivity, with particular
emphasis on neutral lipid fraction; 4) to evaluate of the potential of the
extracellular polymeric substances released by N. cincta as an added value coproduct;
5) to analyse the growth of the species in a 25L columnar
photobioreactor.
Both morphological studies with optical and scanning electronic microscopes
allowed identifying the studied strain as Navicula cincta, a pennate diatom. The
strain was deposited in the Culture Collection of Autotrophic Organism
(CCALA), Czech Republic, under the name Navicula cincta CCALA 984.
The growth rate of N. cincta ranged between 0,29 div. día-1 and 1,42 div. día-1,
while the time of generation ranged between 16,8 hours y 82,5 hours. The
maximum cell densities (CD) were obtained with the SWES-N medium. A model
between the CD and the absorbance was established. It allowed monitoring the
growth of N. cincta in f/2. The spectrofluorometry of chlorophyll a was presented
as an adequate method to evaluate the kinetic of growth and to give information
about the physiological state of the cultures. The kinetic of the chlorophyll a in
vivo presented the same dynamic as the CD in the three culture media
tested.The f/2 medium was suitable for producing a rapid growth followed by an
early stationary phase. Moreover SWES and SWES-N media allowed a
sustained growth along the all considered period. The relationship IFR-Cel
established between the relative fluorescence intensity of Nile Red dyed culture
(NR-RFI) and the DC was proposed as an index to estimate the maximum
neutral lipids accumulation time and, consequently, to determine the biomass
harvesting time. This information was useful for cultures performed in f/2
medium, but this index was not useful for the culture developed in SWES or
SWES-N media, because in these media lipid accumulation was not detected.
The total lipid content (TL) of N. cincta varied between 6- 40% of ash-free dry
weight (% of AFDW). Under growing conditions evaluated, the NL or TAG
represented between 50% and 90% of TL. The highest NL productivity was 10
mg. L-1.d-1 in culture growing at 20ºC in f/2 medium for 10 days. The lowest
values of TL and NL were obtained with SWES-N and SWES, suggesting that,
in these culture media, there was not lipid accumulation. Respect of the
composition of LN, monounsaturated fatty acids (MUFA) were the dominant
class representing from 53% to 60%, followed by saturated fatty acids (SFA)
that they constituted from 21% to 28%. An exception of this pattern occurred in
SWES-N culture, where the contents of MUFA and SFA of NL were similar
(39% and 38%, respectively). Polyunsaturated fatty acids (PUFA) were the
minority fraction in all tested cases. The fatty acid profile of the neutral fraction
was similar under all evaluated culture conditions. The main fatty acids were the
acids palmitic (16:0), palmitoleic (16:1 (n-7)) and eicosapentaenoic (20:5 (n-3)).
Regarding to oil quality parameters, iodine index and content of linolenic acid
were within the limits established by European quality standard EN14214.
These features allowed inferring that the oils of N. cincta constitute a suitable
feedstock for biodiesel production.
In the kinetics of nutrients could be observed a limitation of phosphate and
silicate in f/2 medium, during early stationary phase. In the SWES and SWES-N
media, nutrients did not reach limiting values for growth, which was visualized in
a sustained increase of DC and lower accumulation of LN.
Extracellular polymeric substances (EPS) of N. cincta were classified into
soluble EPS (S-EPS), cell loosely bound EPS (LB-EPS) and cell tightly bound
EPS (TB-EPS). The kinetic of production of these was analyzed in the three
culture media. The EPS-S was the major component in both f/2 and SWES
media (77% and 86% of the total EPS, respectively), while in SWES-N it was a
third of the total EPS. The average production of EPS-S would be related to
stoichiometric ratios N / P. In general, the TB-EPS were more abundant than
the LB-EPS and this could be associated with the benthic habit of the species.
The S-EPS and TB-EPS neutral monosaccharide composition was similar.
Their main components were xylose, mannose and N-acetylglucosamine. The
LB-EPS was largely constituted by galactose and glucose. The
carbohydrate:protein ratio as well as the identification of N-acetylgalactosamine
and N-acetylglucosamine suggest the presence of proteoglycans and/or
glycoproteins in the EPS.
Navicula cincta was grown in a columnar photobioreactor with SWES-N and
CO2. The culture exhibited exponential phase, stationary phase and cell
decreased phase that was not detected at laboratory scale. Biomass production
was 319 mg. L-1. The kinetic of the spectrofluorometry of Nile Red showed
accumulation of LN during stationary phase. The content of TL was 32 (%
AFDW), being the NL 81% of TL. The NL productivity was 51 mg. L-1.d-1. In
regard to fatty acid composition of NL, MUFA percentage was 51%, while the
SFA and PUFA were 32% and 16%, respectively. The main fatty acids were the
acids palmitic, palmitoleic and eicosapentaenoic.
According to the obtained results, it is concluded that the oleaginous microalgae
Navicula cincta can be considered as a potentially useful species for production
of biodiesel. In addition, the simultaneous production of TAG for biodiesel and
EPS as co-product, under a biorefinery context, is presented as a novel
proposal to be applied in sustainable energetic cultures.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/2538 |
| Date | 06 July 2015 |
| Creators | Barnech Bielsa, Guadalupe |
| Contributors | Leonardi, Patricia Inés, Popovich, Cecilia A. |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 2 |
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