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Previous issue date: 2017-07-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A detecção de sequências de DNA in situ por meio de técnicas de citogenética molecular consiste em uma das metodologias mais utilizadas para o mapeamento físico. Embora seja amplamente aplicada na pesquisa genômica, a Hibridização Fluorescente In Situ (FISH - Fluorescent In Situ Hybrid/zation) tem sido considerada uma técnica relativamente demorada, uma vez que requer a construção de uma sonda marcada. A Reação de Amplificação In Situ (PRINS Primed ln situ Label/ing), por sua vez, consiste em uma alternativa sensível e rápida em relação a FISH. No entanto, a especificidade e sensibilidade da técnica de PRINS podem ser influenciadas por fatores especie-específicos. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo adaptar um protocolo de PRINS reprodutível para o mapeamento físico de genes de rRNA 58 em duas espécies com cromossomos de tamanhos relativamente diferentes: Eucalyptus dunnii Maiden e Zea mays L. Inicialmente, meristemas radiculares de ambas as espécies foram sincronizados com hidroxiureia e tratados com o agente anti- tubulínico amiprofos-metil para o acúmulo de metáfases. Em seguida, os meristemas foram submetidos a maceração enzimática e as lâminas confeccionadas pelas técnicas de dissociação celular e secagem ao ar. Após o pré-tratamento das lâminas, um par de primers específicos para a região 58 de E. glóbulus foi utilizado para a reação de PRINS, que consistiu de um único ciclo. A reação foi conduzida em preparações de E. dunnii e Z. mays contendo cromossomos metafásicos morfologicamente preservados, sem resíduos de citoplasma ou sobreposições. A técnica de FISH foi adicionalmente aplicada na espécie Z. mays com o intuito de confirmar os resultados obtidos pela PRINS. O mesmo par de primers foi utilizado para a construção de sondas marcadas com fluorescência, as quais foram posteriormente hibridizadas com o DNA alvo. Os cariótipos de E. dunnii e Z. mays exibiram 2n = 2x = 22 e Zn = 2x = 20 cromossomos, respectivamente. Em ambas as espécies, o cromossomo portador da constrição secundaria foi classificado como o número 6. O protocolo de citogenética clássica associado a reação de PRIN8 resultou em sinais nítidos para a sequência de rDNA 58 tanto em núcleos interfásicos quanto em cromossomos metafásicos de E. dunnii e Z. mays. Em E. dunnii, os genes de rRNA 58 foram mapeados no braço curto do cromossomo 5, em posição pericentromérica. Na espécie Z. mays, o sinal foi localizado na região terminal do braço longo do cromossomo 2. A técnica de FISH confirmou o resultado obtido pela PRIN8 nessa especie. Embora o tamanho dos cromossomos possa influenciar na resolução de técnicas de citogenética molecular, o protocolo descrito resultou em uma elevada razão sinal:background para ambas as espécies estudadas, evidenciando sua reprodutibilidade. Esse estudo consiste no primeiro relato do mapeamento de sequências específicas em E. dunnii e Z. mays pela PRIN8, contribuindo para o desenvolvimento e aperfeiçoamento das técnicas de mapeamento físico em espécies vegetais. Além disso, a localização dos genes de rDNA 58 ainda não se encontra disponível no mapa de ligação ou no genoma sequenciado de Eucalyptus. Dentro desse contexto, a localização física das sequências de rDNA 58 de E. dunnii pode ser integrada aos dados de sequenciamento e auxiliar no alinhamento de sequencias e posicionamento dos genes de rDNA 58 no genoma sequenciado. / The in situ detection of DNA sequences by molecular cytogenetic techniques is one of the most used methodologies for physical mapping. Although widely applied in genomic research, the Fluorescent ln situ Hybridization (FISH) has been considered a relatively time-consuming technique, due to the need of constructing a labeled probe. The Primed ln situ Labelling (PRIN8), on the other hand, is a sensitive and fast alternative to FI8H. Nevertheless, the specificity and sensitivity of the PRIN8 technique may be influenced by species-specific factors. Therefore, the present study aimed to adapt a reproducible PRIN8 protocol for the physical mapping of 58 rRNA genes in two species with chromosomes of relatively different sizes: Eucalyptus dunnii Maiden and Zea mays L. Initially, root meristems of both species were synchronized with hydroxyurea (HU) and treated with the anti-tubulin agent amiprophos methyl (APM) for metaphase accumulation. Then, the meristems were submitted to enzymatic maceration and the slides were prepared by the cell dissociation and air drying techniques. After pre-treatment of the slides, a pair of primers specific to the 58 region of E. globulus was used to the PRIN8 reaction, which consisted of a single cycle. The reaction was conducted on preparations of both E. dunnii and Z. mays containing morphologically preserved metaphasic chromosomes, without cytoplasmic debris or overlaps. The FISH technique was additionally conducted in the species Z. mays with the aim to confirm the results obtained by PRIN8. The same pair of primers was used for constructing the fluorescently labeled probes, which were subsequently hybridized to the target DNA. The karyotypes of E. dunnii and Z. mays exhibited 2n = 2x = 22 and 2n = 2x = 20 chromosomes, respectively. In both species, the chromosome carrying the secondary constriction was classified as number 6. The classical cytogenetics protocol associated with PRIN8 resulted in clear signals for the 58 rDNA sequence in both interphase nucleus and metaphase chromosomes of E. dunnii and Z. mays. ln E. dunnii, the 58 rRNA genes were mapped on the short arm of chromosome 5, in pericentromeric position. In the species Z. mays, the signal was located in the terminal region of the chromosome 2 long arm. The FISH technique confirmed the result obtained by the PRINS reaction in this species. Although the chromosome size may influence the resolution of molecular cytogenetic techniques, the described protocol resulted in a high signal:background ratio for both studied species, evidencing its reproducibility. This study comprises the first report on the mapping of specific sequences in E. dunnii and Z. mays by the PRINS technique, contributing to de development and improvement of physical mapping techniques in plant species. In addition, the localization of 58 rDNA genes is not yet available in the linkage map or in the sequenced genome of Eucalyptus. In this context, the physical localization of E. dunnii 58 rDNA may be integrated With sequencing data and assist in sequence alignment and positioning of 58 rDNA genes in the sequenced genome.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/16382 |
| Date | 21 July 2017 |
| Creators | Sattler, Mariana Cansian |
| Contributors | Carvalho, Carlos Roberto de |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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