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Previous issue date: 2017-02-27 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Enterokinase (EC 3.4.21.9) is a heterodimer serine protease, a natural activator of
trypsinogen, capable of cleaving specifically the sequence Asp-Asp-Asp-Asp-Lys.
Due to the high specificity of the recognition site, it became a great tool of
biotechnological interest. It is usually used to remove affinity tags in vitro, of
recombinant proteins. In this work, the molecular cloning strategy resulted in the
construction of the pDMK06, capable of programming the regulated expression of a
heterologous gene ETK-Trx in E. coli. Through the cleavage process with restriction
enzymes NdeI and BamHI, it was possible to obtain the coding sequence of the
fusion protein between enterokinase and thioredoxin (ETK-Trx) of approximately
1259 bp from pENTK plasmid. Then, this sequence was subcloned at NdeI and
BamHI sites of the expression vector pDM02, originating the recombinant plasmid
pDMK06. This vector contains the TH2 promoter, which is efficiently regulated by Lac
operator/repressor. E. coli JM110 cells transformed with the recombinant plasmid
showed smaller growth in a solid medium when the expression of the heterologous
protein was induced by IPTG in comparison with the control; however, this effect was
not detected in the liquid medium. Furthermore, the E. coli cells morphology was
analyzed through optical microscopy containing the recombinant plasmid pDMK06,
when it was observed, all through the growth time, modifications on cell morphology,
characterized by the formation of filaments in those induced with IPTG, in
comparison with the control. For expression analysis of the recombinant protein ETKTrx,
polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE was performed with the samples
that grew with IPTG induction for eight hours. The results showed that the protein
ETK-Trx is about 47 kDa with a high level of expression at the insoluble fraction,
probably as an inclusion corpuscle. The high levels of expression of ETK-Trx protein
occurred in a perfectly regulated way, showing the functionality of the pDM02
plasmid expression/regulation system. / A enteroquinase (EC 3.4.21.9) é uma serino protease heterodimérica, ativadora
natural do tripsinogênio, capaz de clivar especificamente a sequência Asp-Asp-Asp-
Asp-Lys. Devido à alta especificidade do sítio de reconhecimento tornou-se uma
ferramenta de grande interesse biotecnológico. É comumente utilizada para a
remoção in vitro de marcas de afinidade, como etiquetas de fusão (tags) de
proteínas recombinantes. No presente trabalho, a estratégia de clonagem molecular
resultou na construção do plasmídeo pDMK06, que é capaz de programar a
expressão heteróloga regulada do gene ETK-Trx em E.coli. Por meio do processo de
clivagem com as enzimas de restrição NdeI e BamHI foi possível obter a sequência
codificadora da proteína de fusão entre enteroquinase e tiorredoxina (ETK-Trx) de
aproximadamente 1259 pb partir do plasmídeo pENTK, a seguir essa sequência foi
subclonada nos sítios de NdeI e BamHI do vetor de expressão pDM02, originando o
plasmídeo recombinante pDMK06. Esse vetor contém o promotor TH2 que é
regulado eficientemente pelo sistema operador/repressor Lac. Células de
E.coliJM110 transformadas com o plasmídeo recombinante mostram menor
crescimento em meio sólido quando a expressão da proteína heteróloga era
induzida por IPTG em relação ao controle, porém esse efeito não foi detectado em
meio líquido. Além disto foi analisado por microscopia ótica a morfologia das células
de E.colicom o plasmídeo recombinante pDMK06, onde observou-se no decorrer do
tempo de crescimento e indução, alterações na morfologia celular caracterizada de
filamentação das células induzidas com IPTG quando comparadas com o controle.
Para análise da expressão da proteína recombinante ETK-Trx utilizou-se a
eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE das amostras referentes a 8 horas
de crescimento e indução com IPTG. Os resultados obtidos apresentaram a proteína
ETK-Trx com tamanho aproximado de 47kDa com alto nível de expressão na fração
insolúvel, provavelmente em forma de corpúsculo de inclusão. A expressão em altos
níveis das proteínas ETK-Trx ocorreu de forma perfeitamente regulada mostrando a
funcionalidade do sistema de expressão/regulação do plasmídeo pDM02.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/6783 |
| Date | 27 February 2017 |
| Creators | Pinto, Kerollen Runa, 92994459263 |
| Contributors | ppg_biotec.ufam@yahoo.com.br, Astolfi Filho, Spartaco |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
| Relation | 1984485651082134923, 500 |
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