Bordetella pertussis, o agente etiológico da coqueluche ou tosse comprida, que estabelece a infecção através da fixação bacteriana no epitélio do trato respiratório superior. Os principais mediadores de adesão da bactéria são a toxina pertússica (PT) e a hemaglutinina filamentosa (FHA). A FHA é a adesina majoritária e contém pelo menos 4 domínios: porção Nterminal, domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD) (FHA1141-1279), trinca de aminoácidos Arginina-Glicina-Ácido aspártico (RGD) (FHA1097-1099) e o sítio de ligação a heparina (domínio Hep) (FHA442-863). Neste trabalho, foi realizado a amplificação de duas regiões do domínio de ligação à heparina, as regiões MAL80 (FHA299-873) e HEP (FHA430-873). As regiões foram amplificadas, clonadas no vetor de expressão pAE, expressas utilizando a cepa BL21 SI de E. coli e purificadas. A proteína HEP purificada de E. coli possui baixa afinidade por heparina e não é capaz de aglutinar hemácias. A proteína recombinante HEP purificada foi utilizada para a produção de anticorpos. Através do experimento de ELISA foi demonstrado que o anti-soro anti-HEP é capaz de reconhecer além da região HEP, a região MAL80 e a proteína FHA. Estes resultados foram confirmados por experimentos de Western. Neste período também foi realizada a amplificação do domínio HEP de FHA e da subunidade S1 da toxina pertússica (PT) de B. pertussis através do método de TAP Express. Este método envolve duas reações de PCR e no final do processo é obtido um fragmento que contém uma região promotora (CMV), uma seqüência codificadora e uma região terminadora (SV40), que está pronto para ser introduzido e expresso em animais. De posse deste material e da proteína recombinante HEP, foi realizado o desafio intracerebral com Bordetella pertussis e através do monitoramento dos camundongos foi observado que nenhum dos candidatos testados foi capaz de proteger os animais contra B. pertussis. Foi realizado também a expressão do domínio Hep em lactobacilos, visando um possível sistema de imunizações de mucosas. Os anticorpos produzidos nos camundongos imunizados com a proteína HEP expressa em E. coli, lactobacilos e por vacina de DNA foram capazes de inibir a hemaglutinação promovida pela proteína FHA. / Bordetelfa pertussis, the agent of whopping cough, establishes infection by attaching to the ciliated epithelial cells of the respiratory tract. The bacterial adherence is mediated by pertussis toxin and filamentous hemagglutinin (FHA). FHA is the major adhesin of B. pertussis and displays multipie adherence activities. FHA contains four distin\'ct domains that exhibit specific affinities for different ligands or receptor, the amino-terminal end, the RGD triplet (FHA1097-1099), the lectin domain (FHA1141-1279) and the heparin-binding domain (FHA442-863). In this study, two overlapping regions of the heparin-binding domain, Mal80 (FHA299-873) and Hep (FHA442-873), were amplified by peR and subcloned in pAE expression vectors for E. coli. The fusion proteins in pAE were transformed in E. coli BL21 SI, induced with NaCI 0,3 M and purified using a nickel-charged metal chelating resin. The purified protein has low heparin affinity and does not have hemagglutination activity. The purified protein HEP was used to produce polyclonal antibodies in mouse. The anti-HEP antibodies are able to recognize the HEP, MAL80 and FHA proteins in ELISA and western assays, but anti-FHA only recognized the FHA protein. The genetically detoxified S1 subunit of pertussis toxin and Hep domain were amplified by the TAP Express method. There are two PCR reactions involved in the TAP processo At the end of the process the fragment of interest will carry a CMV promoter and a SV40 terminator and is ready to be introduced into animals or cell by transfection. Groups were immunized with proteins and/or DNA, challenged i.c. with a lethal dose of live Bordetelfa pertussis and the survival was monitored. No groups were protected against the challenge. The recombinant protein HEP were also expressed in Lactobacilfus aiming the development of potential mucosal vaccines. The polyclonal antibodies produce in mouse immunized with DNA and protein Hep expressed in E. coli and Lactobacillus were able to inhibition the FHA hemagglutination activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13112014-173027 |
| Date | 17 March 2003 |
| Creators | Colombi, Débora |
| Contributors | Ho, Paulo Lee |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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