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Previous issue date: 2003-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse fato é causado, em grande parte, pelo surgimento de microrganismos multi-resistentes aos antibióticos. Portanto, apesar da disponibilidade de um grande número de antibióticos de última geração, torna-se ainda fundamental buscar compostos que possam atuar como novas drogas a serem utilizadas no combate as doenças infecciosas. Em plantas, a atividade antimicrobiana pode ser demonstrada por vários tipos de moléculas, como as proteínas relacionadas com a patogenicidade, os componentes orgânicos das plantas, as famílias de peptídeos antimicrobianos e as espécies ativas de oxigênio e nitrogênio. Atualmente, peptídeos antimicrobianos de origem vegetal estão sendo utilizados como modelos para o desenho de novas drogas com aplicação nas áreas agrícolas e de saúde. Deste modo, nosso trabalho objetivou a determinação da metodologia mais eficaz para a purificação dos peptídeos catiônicos, presentes em sementes maduras de soja, com atividade antimicrobiana ou outras, e a caracterização bioquímica destes peptídeos visando à obtenção de informações de importância para a elucidação de suas funções biológicas. Os peptídeos de semente madura de soja foram extraídos, na proporção de 1:5 (gramas semente : mL tampão), em tampão fosfato de sódio 25 mM, pH 7,4, contendo KCl 100 mM, EDTA 2 mM, PVP 1,5% (p/v), tiouréia 2 mM, PMSF 1 mM e benzamidina 1 mM por homogeneização do extrato durante 2 h a 4 °C, em banho de gelo. O extrato obtido foi centrifugado a 20.300 x g a 4 °C e o sobrenadante obtido após o final da extração foi fracionado com sulfato de amônio sólido 35% sat. e centrifugado sob as mesmas condições. O sobrenadante foi aquecido a 80°C por 15 min e novamente centrifugado sob as mesmas condições. Após a diálise do extrato em membrana de exclusão de 1.000 Da, foram realizadas as cromatografias de troca aniônica, em coluna DEAE- Sepharose equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; a de exclusão molecular, em coluna Superdex Peptide equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo 150 mM de NaCl; e a de fase reversa, em coluna C 18 equilibrada com acetonitrila 80% e TFA 0,1%, para obtenção dos peptídeos catiônicos purificados. A análise em espectrômetro de massa das frações eluídas do HPLC indicou a presença de compostos de massas moleculares menores do que 500 Da, 678,61 Da e 700,60 Da, a presença de peptídeos com massas moleculares de 5.809,11 Da, 8.526,97 Da e 14.113,18 Da. A seqüência de aminoácidos do peptídeo de 5.809,11 Da foi determinada e mostrou alta homologia com as cadeias B da pró-insulina humana e de vários outros organismos, da insulina bovina e da insulina de feijão-de-porco (Canavalia ensiformes). Os compostos presentes em dois pools eluídos da cromatografia de exclusão molecular, pool 2 e pool 3, inibiram o crescimento da bactéria Gram-negativa Ralstonia solanacearum, enquanto que, para a bactéria Gram-positiva Clavibacter michiganensis, somente o pool 3 exerceu alguma ação, mas com a inibição do crescimento muito menor do que a obtida para a Ralstonia solanacearum. Assim, estes compostos apresentam potencial antimicrobiano a ser explorado na indústria agrícola. / The infectious diseases are among the main causes of death of the human population. That fact occurs, mainly, for the appearance of multi-resistant microrganisms to the antibiotics. Therefore, in spite of the readiness of a great number of antibiotics of last generation, it becomes still important to look to substances new that can act as new drugs it be used in the combat the infectious diseases. In plants, the antimicrobial activity can be demonstrated by several types of molecules, as the proteins related with the patogenicity, the organic components from the plants, the families of antimicrobial peptides and the active species of oxygen and nitrogen. Now, antimicrobial peptides of vegetable origin are being used as models for the drawing of new drugs with application in the agricultural areas and health. In this way, our work objectified the determination of the most effective methodology for the purification of the cationic peptides, presents in mature seeds of soybean, with antimicrobial activity or other, and the biochemical characterization of these peptides seeking to the obtaining importance information for the elucidation of its biological functions. The peptides of mature seed of soybean was extracted, in the proportion of 1:5 (grams seed: mL), in 25 mM buffer phosphate, pH 7.4, with 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 1.5% (p/v) PVP, 2 mM thioureia, 1 mM PMSF and 1 mM benzamidine for stirring of the extract during 2 h at 4 °C and centrifuged (20,300 x g, 4 °C). As the first steps of purification, proteins were recovered from a 35% sat. ammonium sulfate precipitation (2h, 4 o C) after centrifugation, incubated at 80 o C for 15min and centrifuged again. After the dialysis of the extract in membrane of 1,000 Da, they were accomplished the chromatography of anion exchangers, in DEAE-Sepharose column equilibrated in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0; the one of gel filtration, in Superdex Peptide column equilibrated in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 150 mM of NaCl; and the one RP- HPLC, in C18 column equilibrated with acetonitrile 80% and TFA 0,1%, for obtaining of the cationic peptides purified. The analysis in mass spectrometer of the fractions eluted from HPLC indicated the presence of composed of smaller molecular mass than 500 Da, 678.61 Da and 700.60 Da, the peptides presence with molecular mass of 5,809.11 Da, 8,526.97 Da and 14,113.18 Da. The sequence of amino acids of the peptide of 5,809.11 Da was determined and it showed high homology with the chain B of the human pro-insulin and of several other organisms, of the bovine insulin and of jack bean insulin (Canavalia ensiformes). The present compositions in two pools eluted of the chromatography of molecular exclusion, pool 2 and pool 3, inhibited the growth of the bacteria Gram-negative Ralstonia solanacearum, while, for the bacteria Gram-positive Clavibacter michiganensis, only the pool 3 exercised some action, but with the inhibition smaller growth than obtained it for the Ralstonia solanacearum. Thus, these matters own antimicrobial potential to be explored in the agricultural industry. / Dissertação importada do Alexandria
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/8770 |
| Date | 27 March 2003 |
| Creators | Nascimento, Danielle Gomes |
| Contributors | Fontes, Elizabeth Pacheco Batista, Romeiro, Reginaldo da Silva, Pereira, Maria Cristina Baracat |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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