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Previous issue date: 2015-06-10 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A expressão de arginase-1 (Arg1) está associada com a patogênese da leishmaniose visceral (LV), embora os mecanismos que norteiam a sua regulação na doença não sejam adequadamente conhecidos. Nesta tese foram explorados os mecanismos de regulação da Arg-1 no modelo experimental hamster, a fim de aplicar o conhecimento para o tratamento da doença. Encontrou-se que células infectadas in vitro com Leishmania (Leishmania) donovani expressaram Arg-1 e inhibiram a produção do óxido nítrico, o que contribuiu para o aumento da carga parasitária. A regulação da Arg1 dependeu do fator de transcrição STAT-6, que foi ativado de forma independente da IL-4. Para explorar outros mecanismos envolvidos na ativação de STAT-6 foi utilizada uma biblioteca quimica de 80 inibidores dos receptores tirosine quinases (RTK) e uma membrana microarranjo revestidas com anticorpos contra proteínas phosphoriladas dos RTK. Desta forma, foi possível identificar a ativação do receptor do fator de crescimento de fibroblasto-1 (FGFR-1) e o receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-IR) nos macrofagos. Além disso, realizou-se uma caracterização mais detalhada da cascata de fosporilação canônica dessos receptores. Experimentos in vitro mostraram que macrófagos infectados com L. donovani aumentaram a transcrição de Arg1 quando foram tratados com os ligantes dos RTK, o FGF-2 e o fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-I), sugerindo que estes RTK tinham um papel na regulação da Arg1 na LV
Quando inibidores químicos do FGFR-1 e IGF-IR foram testados em macrófagos infectados, a Arg1 e o STAT-6 foram inibidos sugerindo uma ligação entre essas vias. De fato, a estimulação com FGF-2 e IGF-I aumentou a fosforilação e a ativação transcripcional do STAT-6, e se observou um efeito aditivo quando a citocina IL-4 foi adicionada, demonstrando a interação positiva destas vias. A inibição do STAT-6 mediante interferência de RNA impediu ou diminuiu significativamente a Arg-1 induzida nos macrófagos infectados e estimulados com FGF-2 e por IGF-I. respectivamente, indicando um papel chave do STAT-6 na Arg-1 induzida pelos RTK. A relevância destes achados experimentais para os seres humanos foi avaliada em cultivos de sangue total de doadores sadios estimulados in vitro e no plasma de crianças durante a doença ativa, um mês, seis meses e até um ano após tratamento. Foi observado um aumento de Arg-1 após o estimulo in vitro com IL-4 e FGF-2 ou IGF-I, consistente com o achado no modelo hamster. Nos pacientes, os níveis plasmáticos de Arg-1 não mudaram com a evolução da doença após e o tratamento e o FGF-2 só apresentou um aumento associado com a resolução um ano após tratamento. Em conclusão, os sinais comuns ativados através do FGF-1R e IGF-IR convergem com a IL-4 para ativar STAT-6 e a transcrição de Arg-1 na LV experimental, mas determinar o papel destes fatores de crescimento na LV humana requer estudos adicionais. Este estudo propõe a base mecanicista da regulação da Arg1 mediada pela convergência da sinalização RTK e IL-4R ao STAT-6 na LV e sugere que os inibidores RTK são de utilidade potencial como tratamento adjuvante da doença / Arginase
-
1 (Arg1)
expression
is associated with the pathogenesis of visceral leishmaniasis (VL) but the
mechanisms that lead to its up
-
regulation on disease are
not completelly
k
nown
.
The objective of this thesis
project was to explore the mecanistic ba
sis of Arg
-
1 regulation in
the experimental hamster model of VL
with the
aim to apply the knowledge to the treatment of the disease. We found that cells infected
in vitro
with
Leishmania
donovani
expressed
Arg1
and
that
nitric oxide
production was inhibite
d
, contibuting to the increased parasite
burden. Arg
-
1 regulation was dependent of the transcription factor STAT
-
6, but the activation of this transcription
factor was independent of
IL
-
4 cytokine. To explore other mechanisms involved in activation of STAT
-
6 and the
expression of Arg1 we used a chemical library of 80 tyrosine kinase receptor (RTK) inhibitors and a protein array
with antibodies against phosphorylated RTKs. This allowed identify the activation of fibroblast growth factor
receptor
-
1 (FGFR
-
1) a
nd insulin
-
like growth factor receptor (IGF
-
IR) and the canonical down
-
stream signaling
cascade. Macrophages infected in vitro with
L. donovani
increased transcription of Arg1 when treated with RTK
ligands (FGF
-
2, IGF
-
I), suggesting a role of these RTKs in
the regulation of the Arg1 in LV.
C
hemical inhibitors
of
the activated receptors were used
to assess the effect on infected macrophages. We found that inhibitors of
FGFR
-
1 and IGF
-
IR inhibited parasite burden, Arg1 and STAT
-
6, suggesting a connection betw
een these routes.
Furthermore, the simultaneous stimulation of RTKs with its ligands FGF
-
2 or IGF
-
I and IL
-
4 increased the
phosphorylation and transcriptonal activation of STAT
-
6 and increased Arg1 in an additive manner, showing a
positive interaction betw
een these signaling cascades. STAT
-
6 inhibition by RNA interference prevented or
significantly diminished the induction of Arg
-
1 in macrophages stimulated with FGF
-
2 and IGF
-
I respectively,
indicating a key role of the STAT
-
6 on Arg
-
1 induced by RTKs. The
relevance of these experimental findings to
humans was evaluated in
stimulated
whole blood cultures of healthy donor’s o
r
plasma of children during active
disease, 1 month, 6 months or after 1
year of treatment
. We found that the
Arg
-
1 induced by
in vitro
stimulation
with IL
-
4 and FGF
-
2 or IGF
-
I,
was
consistent with the animal model. However,
in the patients
plasmatic Arg
-
1 did
not change over the follow
-
up, while
FGF
-
2 increased only after 1 year of treatment. We conclude that the signals
activated throu
gh FGFR
-
1 and IGF
-
I converge to IL
-
4 to activate STAT
-
6 and induce Arg
-
1 in experimental VL
.
This study
propose that the mecanistic basis of the regulation of
Arg1
in VL is mediated by
the convergence of
RTK signaling pathways and IL
-
4R to STAT
-
6
and
sugge
st the potential utility of RTK inhibitors as adjuvant
treatment for
the disease.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/12190 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Osorio Esparza, Elvia Janeth |
| Contributors | Alves, Carlos Roberto, Pessolani, Maria Cristina Vidal, Lopez, Ulisses Gazos, Cruz, Alda Maria da, Melby, Peter C. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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