GARANTIZADO, F. E. A. Caracterização da Proteína desacopladora mitocondrial (pUCP) de Vigna unguiculata (L.) Walp. 2007. 121 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-22T20:26:23Z
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Previous issue date: 2007 / The uncoupling proteins of plants (pUCPs) are integral proteins of membrane, located in the mitochondrial inner membrane, belong the Mitochondrial Anion Carrier Family (MACF). They are responsible for the dissipation as heat of the electrochemical gradient of protons, generated during respiration. In the presence of free fatty acid acids (FFA), the UCPs facilitate the re-entry of protons from intermembrane space for the matrix and these protons are deviated from the influence of the ATP sintase what leads to the inhibition the oxidative phosphorilation. The function of these enzymes completely is still not elucidated, but literature suggests its participation in processes of fruit maturation, in the adaptation to stress conditions and in cell protection by avoiding the production of reactive species of oxygen (EROS). The involvement of this enzyme in adaptive thermogenesis is questionable. The objective of the present work was to characterize the enzymatic activity of pUCP of mitochondria from hypocotyls of Vigna unguiculata (L.) Walp through polarographic assays and to identify the(s) gene(s) of pUCPs, through its expression in different conditions of abiotic stress. The activity of pUCP was evaluated in the presence of fatty acids (palmitic, linoleic, myristic and lauric) and BSA, having succinate and malate as oxidizable substrates at different pHs (6,5, 7,2 and 7,8). The higuest activities were obtained in the presence of linoleic acid, succinate as substrate and with more alkaline pHs (7,2 and 7,8). Degenerate primers, obtained from ten different pUCPs, called pump1 and pump2, has been designed for amplification of the gene fragments through RT-PCR and PCR. The total RNA was isolated from plants leaves of V. unguiculata submitted to different stress conditions (100 mM NaCl, 1 mM H2O2 and 200,67 g/L PEG) and cDNAs fragments amplified by RT-PCR had been purified and cloned in the plasmid PCR4-TOPO. Seven cDNA fragments of approximately 760 pb had been sequenced and presented 100% of identity among themselves. The comparison of the deduced amino acid sequence of this cDNA fragment with those of soybean disclosed 94% of identity with the gene GmUCP1a and 90% of identity GmUCP1b soybean gene. These results suggest that the pUCP gene identified in V. unguiculata (VuUCP1a) is ortologous to the GmUCP1a gene from soybean (Glycine max). The expression of genes of pUCP in beans, under abiotic stress conditions (salinity, oxidative and osmotic conditions) analyzed through RT-PCR disclosed a differential profile what suggests induction of expression of VuUCP1a only in response to salt stress. The genomic DNA of V. unguiculata was isolated and two gene fragments (1700 and 1900 pb) had been amplified by PCR. The amplification of two fragments from the genomic DNA suggests the existence of at least two pUCPs genes in beans what leads to the conclusion of a pUCP multigenic family. / As proteínas desacopladoras de planta (pUCPs) são proteínas integrais de membrana, localizadas na membrana mitocondrial interna, pertencentes a Família de Carreadores de Ânions Mitocondriais (FCAM), responsáveis pela dissipação do gradiente eletroquímico de prótons, gerado pela respiração, como calor. Na presença de ácidos graxos livres (AGL), as pUCPs facilitam a reentrada de prótons do espaço intermembranar para a matriz, desviando-os da ATP Sintase, inibindo assim a fosforilação oxidativa. A função dessas enzimas ainda não está completamente elucidada, mas a literatura sugere a sua participação em processos de amadurecimento de frutos, adaptação a situações de estresses bióticos e abióticos e proteção da célula evitando a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS). Sua participação na termogênese adaptativa é questionável. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a atividade enzimática da pUCP de mitocôndrias de hipocótilos de Vigna unguiculata (L.) Walp através de ensaios polarográficos, identificar o(s) gene(s) das pUCPs, estudando a sua expressão em diferentes situações de estresses abióticos. A atividade da pUCP foi avaliada em presença de ácidos graxos (palmítico, linoléico, mirístico e láurico) e BSA tendo succinato e malato como substratos e distintos pHs (6,5, 7,2 e 7,8). As maiores atividades foram obtidas com ácido linoleico na presença de succinato em pHs mais alcalinos (7,2 e 7,8). Primers degenerados a partir de dez diferentes pUCPs, denominados pump1 e pump2, foram desenhados para a amplificação dos fragmentos gênicos por RT-PCR e PCR. Isolou-se o RNA total de folhas de plântulas de V. unguiculata submetidas a diferentes condições de estresses (NaCl 100mM, H2O2 1mM e PEG 200,67g/L) que foram amplificados por RT-PCR, purificados e clonados no plasmídio pCR4-TOPO. Sete fragmentos gênicos de aproximadamente 760 pb foram seqüenciados, apresentando 100% de identidade entre si. A comparação da seqüência deduzida de aminoácidos desse fragmento de cDNA com a soja revelou 94% de homologia com GmUCP1a e 90% de homologia com GmUCP1b. Os resultados sugerem que o gene do feijão identificado em V. unguiculata (VuUCP1a) é ortólogo ao gene GmUCP1a de soja (Glycine max). A expressão de VuUCP1a em feijão em condições de estresses abióticos (salino, oxidativo e osmótico) através de análise por RT-PCR revelou um perfil diferencial, sugerindo indução de expressão de VuUCP1a apenas em resposta ao estresse salino. Isolou-se o DNA genômico de V. unguiculata e dois fragmentos gênicos (1700 e 1900pb) foram amplificados por PCR. A amplificação de dois fragmentos distintos a partir do DNA genômico sugere a existência de pelo menos dois genes codificando pUCPs em feijão, sendo assim, a pUCP é codificada por uma família multigênica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/10772 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Garantizado, Francisco Edson Alves |
| Contributors | Melo, Dirce Fernandes de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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