El tracte gastrointestinal de l’individu humà es troba colonitzat per la microbiota intestinal. L’epiteli intestinal actua com a barrera física per impedir que els bacteris accedeixin a òrgans essencials, i representa la superfície on l’hoste pot interaccionar amb el bacteri. Independentment de si el balanç final d’aquesta interacció és positiu o negatiu, la gran pressió selectiva que té lloc en la interfase bacteri-hoste determina que ambdues parts hagin desenvolupat múltiples maneres de comunicar-se.
En aquest treball s’han abordat dos aspectes relacionats amb la interacció bacteri-hoste. Per una banda, com a model d’adaptació metabòlica durant l’adhesió d’Escherichia coli a enteròcits, s’ha estudiat la regulació de l’operó lldPRD. Per altra banda, s’ha aprofundit en l’estudi dels mecanismes de secreció de la proteïna multifuncional gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) de soques patògenes i probiòtiques com a mecanisme que el bacteri utilitza per interaccionar amb l’hoste.
En referència a l’adaptació metabòlica d’E. coli durant l’adhesió, s’ha seleccionat un dels gens sobreexpressats en E. coli enterohemorràgica (EHEC) adherida a membranes plasmàtiques d’eritròcits, el gen lldR (Dahan i col, 2004). lldR codifica la proteïna reguladora de l’operó lldPRD, responsable del metabolisme d’L-lactat en E. coli, però no es tenen evidències experimentals sobre la regulació d’aquest operó. En aquesta tesi s’ha assignat a LldR un paper dual com a activador de la transcripció en presència d’L-lactat en el medi, i com a repressor en absència d’aquest, a través de la formació d’un bucle de DNA format mitjançant la unió d’LldR a dues seqüències operadores. El fet que l’operó lldPRD, estigui sobreexpressat en bacteris adherits podria representar un mecanisme pel qual el bacteri s’adapta a l’augment local de la concentració d’L-lactat a la superfície intestinal, contribuint a l’establiment d’una relació entre l’enterobacteri i l’a cèl·lula hoste.
Pel que fa als mecanismes de secreció i interaccions de la GAPDH bacteriana amb l’hoste, prèviament s’havia identificat aquesta proteïna com a secretada per soques patògenes EHEC i EPEC (E. coli enteropatògena) crescudes en determinats medis de cultiu. En el present treball s’ha determinat la participació de dos mecanismes de secreció alternatius, el de tipus injectisoma (T3aSS), actiu en soques patògenes en medi de cultiu eucariota, i un altre mecanisme encara per identificar, actiu en soques patògenes i probiòtiques (E. coli Nissle 1917) en medi de cultiu bacteriològic ric. No es detecta secreció de GAPDH en soques aïllades naturals no patògenes com EcoR26, indicant que la secreció i/o exposició de la proteïna a la superfície representa un avantatge pels bacteris patògens i probiòtics en termes d’adhesió i colonització. Així, s’ha determinat la capacitat d’unió de la GAPDH a fibrinogen i plasminogen. Addicionalment, la GAPDH pot tenir altres funcions en la relació amb l’hoste. En aquest estudi s’ha determinat la capacitat de la GAPDH de ser internalitzada en la cèl·lula eucariota en forma de vesícules. També és possible que la proteïna sigui translocada al citoplasma de la cèl·lula hoste a través del T3SS. En aquest treball, s’ha observat la interacció de GAPDH amb els factors d’elongació de la traducció EF1Bγ i EF1Bα de l’enteròcit. Finalment, en aquest estudi s’ha comprovat la capacitat de la proteïna GAPDH de ser ADP-ribosilada. La GAPDH, però, també té activitat ADPribosiltransferasa, fet que podria determinar la seva participació en la modificació de proteïnes de l’hoste en el cas de ser translocada al citoplasma de la cèl·lula eucariota.
En el context de la comunicació o diàleg entre el bacteri i l’hoste colonitzat, els resultats d’aquest treball ajuden a entendre alguns dels mecanismes pels quals les soques d’E. coli patògenes i/o probiòtiques s’adapten a l’entorn intestinal i s’adhereixen a l’epiteli més eficaçment que els bacteris que no presenten aquests mecanismes. / Human gastrointestinal tract is colonized by intestinal microbiota. The intestinal epithelium acts as a physical barrier and represents the area where host-bacteria interaction occurs. The selective pressure in this interface determines that both parties have developed many ways to communicate.
In this work we have addressed two aspects of host-bacteria interaction. As a model for metabolic adaptation of Escherichia coli adherence to enterocyte, we have studied the regulation of lldPRD operon. As a mechanism that bacteria use to interact with the host, we have analysed the secretion mechanisms of the multifunctional protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of pathogenic and probiotic strains. lldR encodes the regulator protein of the lldPRD operon, which is responsible for the metabolism of L-lactate in E. coli. We have demonstrated that LldR plays a dual role as an activator of transcription of the operon in the presence of L-lactate, and as a repressor in absence of the inducer through the binding of LldR to two operator sequences and the formation of a DNA loop. The fact that the lldPRD operon is overexpressed in attached bacteria might be a mechanism used by bacteria to adapt to increased local concentration of L-lactate on the intestinal surface.
We have determined the participation of two alternative mechanisms in bacterial GAPDH secretion. The T3SS injectisome is active in pathogenic strains growing in eukaryotic culture medium. Another mechanism is active in pathogenic and probiotic strains (E. coli Nissle 1917) growing in rich bacteriological medium. No secretion was detected in natural non-pathogenic isolates, indicating that secretion or exposure of the protein on the surface confers advantages to pathogenic and probiotic bacteria in terms of adhesion and colonization. We have also determined that GAPDH binds fibrinogen and plasminogen. Moreover, we have demonstrated that GAPDH possesses ADPrybosiltranferase activity, which might determine its participation in the modification of host proteins when translocated to the cytoplasm of eukaryotic cells. In the context of host-bacteria communication, these results provide insight into the adaptation mechanisms that allow some pathogenic and/or probiotic E. coli strains to adapt more effectively to the intestinal environment than bacteria lacking these mechanisms.
Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/32127 |
Date | 10 March 2010 |
Creators | Aguilera Gil, Maria Laura |
Contributors | Badía Palacín, Josefa, Baldomà Llavinés, Laura, Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia) |
Publisher | Universitat de Barcelona |
Source Sets | Universitat de Barcelona |
Language | Catalan |
Detected Language | English |
Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
Format | 196 p., application/pdf |
Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.002 seconds