As L-asparaginases bacterianas (L-asparaginase amidohidrolase, E.C.3.S.1.1) são enzimas de alto valor terapêutico devido ao seu uso no tratamento de leucemia linfocítica aguda. A L-asparaginase da Escherichia coli por ser uma enzima periplásmica com alta afinidade, é particularmente efetiva em certas terapias de câncer infantil. Muitos agentes terapêuticos recentes são proteínas e peptídeos que surgiram do design molecular de drogas e tecnologia de DNA recombinante. Numerosos estudos têm demonstrado que aditivos preservam a estrutura e a atividade biológica de cada molécula destas proteínas. Entretanto, o mecanismo de proteção, pelo qual estes aditivos funcionam, não tem sido totalmente elucidado. O objetivo do presente trabalho é investigar detalhadamente o efeito da liofilização sobre a estrutura e a atividade enzimática da L-asparaginase, tanto em células íntegras de Escherichia coli, como na enzima purificada. Até recentemente a maneira para se avaliar o comportamento de um aditivo e o comportamento da água na estabilização de uma proteína durante a liofilização consistia na medida dos parâmetros de atividade após a reidratação, porém atualmente modernas técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de baixa resolução são utilizadas para se entender o comportamento da água nas interações com proteínas. E a Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier apresenta grande potencial no estudo de estabilização de proteínas durante a liofilização. Utilizou-se o cálculo de porcentagem de retenção de atividade para expressar os valores de atividade enzimática estudados. Estes cálculos foram realizados para os sistemas congelados e para os sistemas congelados e liofilizados. Os sistemas foram tratados em velocidades de congelamento diferentes (20°C/min, SOC/min e 2°C/min), sendo em seguida liofilizados por 24 horas. São apresentados resultados sobre o efeito das diferentes velocidades de congelamento e o efeito da liofilização nos diferentes sistemas aditivo-enzima e aditivo-célula. Utilizaram-se os aditivos: sacarose, maltose, lactose, inositol, manitol e trealose testados em diferentes concentrações (30, 90 e 150mM). Para identificar quais as condições e os aditivos que apresentaram uma crioproteção satisfatória. Nos sistemas maltose-enzima e trealose-enzima observou-se um aumento da crioproteção com o aumento da concentração de aditivo. Para os sistemas maltose-enzima, congelados lentamente, os resultados de retenção de atividade foram: 8,67%, 14,02% e 30,80% respectivamente para 30, 90 e 150mM. O sistema enzima-maltose (150mM) congelado rapidamente e liofilizado apresentou a maior retenção de atividade (111,11 %) e também o maior valor de T2 (81µs) nos resultados referentes a RMN. Nos sistemas trealose-enzima nas concentrações de 90 e 150mM apresentaram retenção de atividade 89,93% e 79,74%, respectivamente. / Bacterial L-asparaginase (L-asparaginase amidohydrolase, E.C. 3.5.1.1) are enzymes of high therapeutic value due to their use in the treatment of lymphocytic acute leukemia. Escherichia coli L-asparaginase is a periplasmic enzyme of high affinity, particularly effective in some kinds of childhood cancer therapies. Several studies have showed that there are specific stabilizing additives preserve the structure and the biological activity of protein molecules (lyoprotectant). However, the protection mechanism for these excipients has not been totally elucidated yet. The aim of this work was investigate the effect of freeze-drying on the enzymatic activity of L-asparaginase using both the purified enzyme as well as intact cells of Escherichia coli. Until recently the way to evaluate the behavior of an addictive one and the behavior of the water in the stabilization of a protein during the freeze-drying consisted of the measure of the activity parameters after the reidratação, even so now modem techniques of the Nuclear Magnetic Resonance of low resolution have been used to understand the behavior of the water in the interactions with proteins. It is Infrared Spectroscopy for Fourier Transformed it presents a great potential in the study of stabilization of proteins during the freeze-drying. The calculation of percentage of activity retention was used to express the studied values of enzymatic activity. These calculations were accomplished for the frozen systems and for the frozen systems and freeze-dryied. The systems were treated in three speeds of different freezing (20°C/min, 5°C/min and 2°C/min), being the freeze-drying for 24 hours. Results are presented on the effect of the freeze-drying in the different systems addictive-enzyme and addictive-cell. The addictive ones were used: sucrose, maltose, lactose, inositol, manitol and trehalose tested in different concentrations (30, 90 and 150mM), to identify which the conditions and the addictive ones that presented a satisfactory cryoprotection. For the systems enzyme-maltose, frozen slowly, the results of activity retention were: 8,67%, 14,02% e 30,80% to 30,90 e 150mM,respectively . The system enzyme-maltose (150mM) frozen quickly and freeze-dryied presented the largest activity retention (111,11 %) and also the largest value of T2 (81 µs) in the referring results NMR. The systems enzyme-trealose in the concentrations of 90 and 150mM they presented retention of activity 89,93% and 79,74%, respectively.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-13092006-115358 |
| Date | 15 August 2002 |
| Creators | Silva, Regiane da |
| Contributors | Pitombo, Ronaldo Nogueira de Moraes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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