Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2016. / Aspergillus terreus é um fungo filamentoso que produz numerosas enzimas com uma vasta gama de aplicações biotecnológicas. Este estudo tem como objetivo caracterizar a produção das enzimas lignocelulolíticas de A. terreus, estirpe BLU24, crescido em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais (bagaço de cana de açúcar, casca do grão de soja e piolho de algodão sujo) e analisar a expressão diferencial desses genes em resposta a essas fontes de carbono. A crescente utilização de resíduos como bagaço de mandioca, bagaço de cana de açúcar, polpa de beterraba, polpa de maçã, farelo de trigo, etc evidencia que diferentes áreas da indústria utilizam estes resíduos como matéria prima para a produção de etanol, enzimas, cogumelos, ração animal, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabólitos secundários, produtos farmacêuticos. A. terreus BLU24 foi crescido à 28 ° C sob agitação (120rpm) ao longo de um período de dez dias. O secretoma foi analisado de acordo com as atividades enzimáticas de xilanase, endoglucanase, mananase, pectinase e FPase identificadas de acordo com o método DNS. Dentre todas as atividades estudadas a que foi mais expressiva foi à atividade relacionada com proteínas do tipo xilanases. A atividade de xilanase após cultivo no meio contendo piolho de algodão sujo atingiu um valor máximo de 0,935 UI.mL-1 no sexto dia de cultivo, já no meio com bagaço de cana de açúcar este valor foi de 1,017 UI.mL-1 no sétimo dia e no meio contendo casca do grão da soja a atividade máxima foi também no sétimo dia, atingindo um valor de 1,019 UI.mL-1. A maior atividade de CMCase foi no bagaço de cana de açúcar que atingiu um valor máximo no quarto dia de cultivo (0,275 UI.mL-1). Já a maior atividade de pectinase foi no substrato casca do grão da soja no terceiro dia de cultivo (0,494 UI.mL-1) e a maior atividade de FPase foi também na casca do grão da soja no sétimo dia de cultivo (0,494 UI.mL-1). O preparo das bibliotecas de cDNA de mRNA do fungo A. terreus foi conduzida utilizando o kit RNA TruSeq Kit v2 (® Illumina, Inc.). A. terreus também mostrou um desempenho significativo como produtor de holocellulases. As bibliotecas de cDNA sequenciadas produziu uma média total de 2,7 GB, com cerca de 27 milhões de leituras. Aproximadamente 81% das leituras exibiram uma boa qualidade (Q> = 30). A caracterização deste transcritoma oferece a descoberta de genes promissores para aplicação em diferentes áreas da indústria biotecnológica. As análises de RNA-seq do isolado A. terreus BLU24 cultivado em bagaço de cana de açúcar identificaram um total de 102 genes CAZy, já em casca do grão da soja o total de genes CAZy foi 159 (padj <0.01). Tanto no tratamento contendo bagaço de cana de açúcar quanto no tratamento contendo casca do grão da soja comparado a glicose, as famílias CAZy mais abundantes foram a GH3 e GH43. Análises das famílias glicosil hidrolases revelou regulação positiva de 6 genes que codificam proteínas da família GH5, 7 genes da família GH43 e 8 genes da família GH3 no tratamento com bagaço de cana de açúcar contra a glicose. Similarmente no tratamento com casca do grão da soja contra a glicose foram relatados 7 genes que codificam proteínas da família GH5, 6 genes da família GH10, 11 genes da família GH3 e 12 genes da família GH43 (p<0,01). Os genes que codificam proteínas relacionadas com a degradação da biomassa são expressos nas duas fontes de carbono estudadas, porém alguns desses genes com expressão diferencial ocorreram apenas no bagaço de cana de açúcar ou apenas na casca do grão da soja nos tempos de 36 e 48 horas. O estudo do transcritoma global do fungo A. terreus BLU24 identificou uma grande quantidade de genes que codificam enzimas utilizadas na degradação da parede celular vegetal e também fatores de transcrição que são importantes neste processo. A. terreus é conhecido por ser um bom produtor de enzimas envolvidas na degradação da biomassa vegetal e uma característica importante deste fungo é o fato dele ser termofílico e com isso poder produzir enzimas termotolerantes com diferentes aplicações na indústria têxtil, biocombustível, papel, alimento e etc. / Aspergillus terreus is a filamentous fungus that produces numerous enzymes with a wide range of biotechnological applications. The aim of this study was to characterize the production of lignocellulolytic enzymes in A. terreus strain BLU 24 following culture in growth media containing agro-industrial residues (sugar cane bagasse, soy bean hulls and cotton louse) and analyze differential gene expression in response to carbon source. Given the abundance of agricultural waste materials such as cassava bagasse, sugar cane bagasse, sugar beet pulp, apple pulp and wheat bran, numerous applications are under development using such residues as raw material. These include utilization in production of ethanol, industrial enzymes, edible mushrooms, animal feed, organic acids, amino acids, secondary metabolites, and pharmaceutical products. A. terreus BLU 24 was grown at 28 ° C under agitation (120rpm) over a period of ten days. The secretome was analyzed for xylanase, endoglucanase, mannanase, pectinase and FPase enzyme activities, according to the DNS method. Among all the activities studied, most significant enzyme activities were related to xylanase, with activity reaching a maximum of 0.935 UI.mL-1 after six days incubation in minimal growth medium plus cotton louse as sole carbon source, 1.017 UI.mL-1 after seven days incubation with sugarcane bagasse as carbon source, and 1,019 UI.mL-1after seven days incubation with soybean hulls as carbon source. Most CMCase activity was observed on sugarcane bagasse, with a peak in activity by the fourth day of cultivation (0.275 UI.mL-1). Pectinase activity was higher on soybean hulls as substrate after cultivation during three days (0.494 UI.mL-1) , with highest FPase activity observed on soybean hulls in seven day old cultures (0.494 IU. ml- 1).Characterization of the fungal transcriptome was conducted to identify candidate genes for application in different areas of the biotechnology industry. cDNA libraries were prepared from A. terreus BLU 24 mRNA following 36 h and 48 h growth on sugarcane bagasse and soybean hull-derived carbon sources. Illumina Hiseq sequencing of cDNA libraries produced a mean total of 2.7 GB, equaling approximately 27 million reads. A total of 81% of the reads exhibited good quality (Q> = 30). RNA-seq analysis of A. terreus BLU 24 identified a total of 102 expressed cazy genes following growth on sugarcane bagasse with 159 identified following growth on media with soybean hull carbon source (padj <0.01). For both carbon source treatments, compared to glucose, the most abundant Cazy gene families were GH3 and GH43. Analysis of the glycosyl hydrolase family revealed up-regulation of six genes encoding GH5, seven GH43 genes and eight GH3-encoding genes following cultivation on sugarcane bagasse against glucose. Similarly, cultivation on soybean hulls against glucose revealed seven genes that encode protein family GH5, six genes encoding GH10, 11 genes encoding GH3 and 12 genes encoding the GH43 family (p<0,01). Genes encoding proteins related to the degradation of biomass were expressed during growth on the two carbon sources studied, with differential expression in relation to glucose occuring for different sets of genes in sugarcane bagasse and soybean hulls at each growth period of 36 and 48 hours. This global analysis of the transcriptome for the fungus A. terreus BLU 24 following cultivation on lignocellulosic carbon sources enabled identification of a number of genes encoding enzymes and transcription factors involved in the degradation of the plant cell wall. A. terreus is recognized as a promising fungal species for production of enzymes involved in the degradation of plant biomass. Given that this fungus is also able to produce thermophilic enzymes, considerable potential exists in the application of the characterized candidate genes in different applications in the textile, biofuel, paper, food and feed industries.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/22075 |
| Date | 02 February 2016 |
| Creators | Corrêa, Camila Louly |
| Contributors | Miller, Robert Neil Gerard |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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