L'expression génique régule essentiellement la fonction d'une cellule. La régulation précise de l'expression génique par différents régulateurs, tels que les miARN, est importante pour les processus biologiques dans différents organismes, notamment le modèle de nématode Caenorhabditis elegans. Les miARN sont des courts ARN non-codants d'environ 21 nucléotides impliqués dans la régulation posttranscriptionnelles des gènes en se liant à la région 3'UTR des ARN. Le pri-miARN, transcrit par l'ARN polymérase II, est traité par le complexe microprocesseur (Drosha-DGCR8) dans le noyau, puis le pré-miARN est transporté vers le cytoplasme. Le pré-miARN, clivé par Dicer, produit un petit duplex d'ARN, composé d'une paire de miARN matures (brin guide), qui forme le miRISC lorsque chargé à l'Argonaute avec GW-182/TNRC6, et de miARN passagers (brin étoile), qui est éliminé. Le facteur clé fonctionnel dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes est l'Argonaute, composé de quatre domaines majeurs : N-terminal, PAZ, MID et PIWI. En fonction de certains acides aminés du domaine PIWI, ressemblant à RNase H, l'Argonaute peut agir comme une endonucléase en coupant les liens phosphodiesters des ARN, ce qu'on appelle activité de découpe, activité activée par la tétrade catalytique DEDH en présence de cations divalents (Mg+2, Mn+2) et d'une complémentarité presque parfaite ou parfaite entre le court ARN et la cible. Bien que l'activité de découpe de l'Argonaute se soit révélée particulièrement essentielle dans d'autres voies de courts ARN non codants (piARN, siARN) chez différents organismes ainsi que dans la voie des miARN chez les plantes, la contribution de l'Argonaute-slicer dans la voie des miARN chez les systèmes animaux reste peu étudiée puisque, notamment, il n'y a pas de complémentarité parfaite entre les miARN et les cibles chez les animaux, et donc, les Argonautes slicers chez les animaux ne participent pas au clivage de la cible. Néanmoins, les Argonautes chez les animaux portent toujours la tétrade catalytique, responsable de l'activité de découpe. Des chercheurs ont montré que les Argonautes sont essentielles dans la production de miARN spécifiques (miR-451, miR-486) chez les vertébrés et certains groupes ont également montré le rôle de l'Argonaute dans la voie des miARN dans les cellules. Malgré ces études, à ce jour, aucune publication n'a montré la contribution plus large et la pertinence des Argonautes endogènes possédant une activité de découpe spécifiques des miARN chez les animaux. Dans ce travail de thèse, nous abordons l'objectif de « l'Argonaute-slicer » dans la voie des miARN. En prolongement du travail publié, réalisé en utilisant le système transgénique dans notre laboratoire par Bouasker et Simard, il était impératif pour nous de comprendre la contribution des Argonautes portant le motif DEDH endogènes. L'objectif de ma thèse était d'investiguer la contribution globale des Argonautes qui possède la tétrade catalytique dans la voie des miARN. En utilisant le système CRSPR-Cas9, nous avons généré des mutants d'Argonautes, en modifiant leur résidus catalytiques. Ensuite, nous avons utilisé des techniques de génétique et de biologie moléculaire pour aborder notre objectif dans le système modèle de C. elegans, portant des Argonautes exclusivement impliqués dans la voie des miARN. Au cours de l'étude, nous avons découvert que la contribution physiologique et moléculaire de l'activité de découpe des Argonautes endogènes dans la voie des miARN n'est pas essentielle pour la viabilité, contrairement à l'étude transgénique. Bien que dans des contextes spécifiques et des conditions stressantes, les mutants aient montré des changements significatifs dans les phénotypes physiologiques et moléculaires, notre analyse confirme un rôle modéré de l'Argonaute slicer dans les voies canoniques des miARN en conditions de laboratoire. De plus, ce travail montre également de façon évidente l'importance de l'analyse de la fonction moléculaire d'un gène endogène dans un organisme modèle par rapport à l'utilisation d'un système de surexpression transgénique in cellulo ainsi que dans un organisme modèle. Dans l'ensemble, cette étude systémique délimite la pertinence des résidus catalytiques des Argonautes endogènes dans la voie des miARN dans un système modèle de nématode établi et largement reconnu. / The gene expression essentially regulates the function of a cell. The precise regulation of gene expression using different regulators, such as miRNA, is essential for the biological processes in different organisms, including the nematode model organism Caenorhabditis elegans. The miRNAs are about 21 nt long short noncoding RNAs involved in PTGS. The production of miRNAs involves multiple sequential steps in the nucleus and cytoplasm, and then the mature miRNA binds to the complementary 3'UTR to regulate gene expression. The pri-miRNA, transcribed by RNA polymerase II, is processed by the microprocessor complex (Drosha-DGCR8) in the nucleus, and thereafter pre-miRNA is transported to the cytoplasm. Pre-miRNA, cleaved by Dicer in the cytoplasm, produces a small RNA duplex, which consists of a pair of mature miRNA (guide strand) and passenger miRNA (star strand). The passenger strand is discarded, and mature miRNA-loaded Argonaute, along with GW-182/ TNRC6, forms miRISC, binds to the target, and brings upon various factors to trigger PTGS. The functional key factor in PTGS is Argonaute, which is made up of four major domains: N-terminal, PAZ, MID, and PIWI. Depending on the amino acids at particular positions in the PIWI domain, resembling RNase H, Agoanute can act as an endonuclease to cleave phosphodiester bonds in the RNA backbone. This catalytic function of Argonaute is called slicer activity. In the presence of divalent cations (Mg+2, Mn+2), a specific catalytic tetrad (DEDH) carrying Argonaute can cleave target mRNA due to near-perfect or perfect complementarity between small RNA and target. Even though the slicing activity of Argonaute has been found particularly essential in other small RNA pathways (pi-RNA, si-RNA) in different organisms as well as in miRNA pathway in plants, the contribution of slicer-Argonaute in miRNA pathway in animal systems remains understudied due to varying limiting factors. Notably, there is the absence of perfect complementarity between miRNAs and targets in animals, compared to plants, and therefore, the slicer Argonautes in animals do not take part in target cleavage during PTGS. Nonetheless, Argonautes, involved in the miRNA pathway in animals, still carry the catalytic tetrad, which is responsible for the slicer activity. Researchers have shown that slicer Argonaute is essential in the production of specific miRNAs (miR-451, miR-486) in vertebrates, and some groups also showed the role of slicer Argonaute in miRNA pathway in cellulo. Despite these studies, to date no reports showed the broader contribution and relevance of the function of miRNA-specific endogenous slicer-Argoanutes in animals. In this doctoral work, we set out to address the purpose of the slicer-Argoanutes in the miRNA pathway. In continuation of the published work done previously using the transgenic system in our lab by Bouasker and Simard, it was imperative for us to understand the contribution of endogenous slicer Argonautes. The aim of my Ph.D was to investigate the comprehensive contribution of endogenous Argonautes, carrying catalytic tetrad, in the miRNA pathway. Using current gene editing technology, CRSPR-Cas9 system, we generated Argonaute mutants by altering catalytic residue. Then, we employed genetics and molecular biology techniques to address our aim in the C. elegans model system, carrying Argonautes exclusively implicated in the miRNA pathway. During this study, we found out that the physiological and molecular contribution of endogenous slicer-Argonautes in the miRNA pathway is not essential for viability, contradictory to the transgenic research. Even though in specific backgrounds and stressful conditions, mutants showed significant changes in physiological and molecular phenotypes, our analysis confirms a moderate role of slicer-Argonaute in canonical miRNA pathways in laboratory condition. Moreover, this work also glaringly shows the importance of analysis of the molecular function of an endogenous gene in a model organism compared to the usage of a transgenic overexpression system in cellulo as well as in a model organism. Overall, this systemic study delineates the relevance of slicing residues of endogenous Argonautes in the miRNA pathway in an established and widely recognized nematode model system.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/152189 |
| Date | 21 October 2024 |
| Creators | Pal, Anisha |
| Contributors | Simard, Martin |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xxi, 132 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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