Die Kommunikation von Zellen untereinander und mit ihrer Umgebung stellt die Grundlage für die Existenz lebender uni- sowie multizellulärer Organismen dar. Dabei müssen Zellen zwischen diversen chemischen und physikalischen Stimuli differenzieren. Ermöglicht wird dies durch eine individuelle Ausstattung mit membranständigen und zytosolischen Rezeptoren. Eine der größten und diversesten Superfamilien membranständiger Rezeptoren bildet die Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). GPCR weisen eine charakteristische, sehr ähnliche räumliche Grundstruktur auf. Sie besitzen eine Kerndomäne aus sieben transmembranären, im Wesentlichen hydrophoben α-Helices, die durch drei intrazelluläre sowie drei extrazelluläre Schlaufen miteinander verbunden sind. Eine häufig auftretende vierte Schlaufe wird durch die Palmitoylierung eines intrazellulär lokalisierten C-Terminus an einem Cysteinrest und die hohe Affinität des Palmitats zur Lipiddoppelschicht gebildet. Der N-Terminus des Rezeptors befindet sich extrazellulär, während der C-Terminus in den Intrazellularraum reicht.
Im Vergleich zu anderen Rhodopsin-ähnlichen GPCR zeichnen sich die Glykoproteinhormonrezeptoren (GPHR) durch einen großen extrazellulären N-Terminus aus, der das aktivierende Hormon bindet. Die Funktion des N-Terminus beschränkt sich jedoch nicht auf die Ligandenbindung. Er ist auch an der direkten Aktivierung der Transmembrandomäne (TMD) beteiligt. Die Signalvermittlung erfolgt über einen intramolekularen Agonist. Durch Deletions- und Mutagenesestudien sowie identifizierte pathogene Mutationen ist dessen Existenz in GPHR nachgewiesen. Stimulationsversuche mit von der Hinge-Region innerhalb des extrazellulären N-Terminus abgeleiteten Peptiden, die alle drei GPHR aktivieren, führten in Vorarbeiten zur Spezifizierung der hochkonservierten agonistischen Sequenz FNPCEDIMGY (p10-Region). Diese ist am Übergang des N-Terminus zur ersten Transmembranhelix lokalisiert und zwischen den paralogen und orthologen GPHR hochkonserviert.
Mit dieser Arbeit wird die Identität des intramolekularen Agonists bestätigt. Es wird gezeigt, dass die Einnahme des aktiven Zustandes aller GPHR die Integrität der p10-Region und ihre spezifischen intramolekularen Interaktionen mit weiteren Rezeptordeterminanten erfordert. Folglich können die GPHR, wie auch Rhodopsin, Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs) und Adhäsions-GPCR, einer Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zugeordnet werden, deren Ligand kovalent an den Rezeptor gebunden vorliegt oder selbst Teil des Rezeptorproteins ist. Auf die GPHR trifft dabei letzteres zu.:Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einführung
1.1 Struktur und Signaltransduktion G-Protein-gekoppelter Rezeptoren
1.2 Die Glykoproteinhormonrezeptoren
1.2.1 Topologie und Struktur der GPHR
1.2.2 Die Physiologie der GPHR und ihrer Liganden
1.2.3 GPHR-assoziierte Pathogenese
1.2.3.1 Mutationen des LH-Rezeptors
1.2.3.2 Mutationen im TSH-Rezeptor
1.2.3.3 Morbus Basedow und Hashimoto-Thyreoditis
1.2.4 Die Signalweiterleitung der Glykoproteinhormonrezeptoren
1.2.5 Modelle des Aktivierungsmechanismus der Glykoproteinhormonrezeptoren
1.3 Aufgabenstellung
2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.2 Zelllinien und Mikroorganismen
2.3 Medien, Puffer und Lösungen
2.3.1 Medien
2.3.2 Medien und Puffer für den cAMP-Akkumulationsassay
2.3.3 Puffer und Lösungen für die Expressionsanalysen
2.3.4 Sonstige Lösungen
2.4 Software
2.5 Kits
2.6 Vektoren
2.7 Methoden
2.7.1 Allgemeine Kulturbedingungen von Bakterien und Zelllinien
2.7.2 Molekularbiologische Standardmethoden
2.7.3 Transiente Transfektion von HEK293-T Zellen
2.7.4 Expressionsanalyse mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)
2.7.4.1 Analyse der Gesamtexpression mittels Sandwich-ELISA
2.7.4.2 Analyse der Oberflächenexpression mithilfe des Oberflächen-ELISA
2.7.5 cAMP-Akkumulationsassay
2.7.6 Luciferase-Reportergenassay
3 Ergebnisse
3.1 Herstellung der Rezeptormutanten und deren funktionelle Charakterisierung im humanen LHR
3.2 Die Erkenntnisse aus der hLHR-Mutagenesestudie sind nicht vollständig auf den
hTSHR übertragbar
3.3 Mutationen innerhalb der p10-Region haben keinen Einfluss auf die Integrität der
hTSHR-Transmembrandomäne
3.4 Die Integrität des Rezeptor-N-Terminus ist grundlegend relevant für die Einnahme einer aktivierbaren Konformation der GPHR
3.5 Die Deletion des N-Terminus wirkt sich nicht auf die Stabilität und Funktionalität der GPHR-Transmembrandomäne aus
3.6 Trypsin führt nicht zur vollen Aktivierung des humanen TSH-Rezeptors
3.7 Mutationen innerhalb der p10-Region können die maximale Rezeptoraktivierung induzieren
3.8 Erstellung eines Homologiemodells anhand der funktionellen Eigenschaften der generierten Mutanten
4 Diskussion
4.1 Die Aktivierung der GPHR stellt hohe Anforderungen an die strukturellen und physikochemischen Eigenschaften des intramolekularen Agonists
4.2 Das Zusammenspiel verschiedener Rezeptorregionen reguliert die Signalaktivität der GPHR
4.3 Die Integrität des N-Terminus der GPHR ist hochrelevant für die Positionierung des intramolekularen Agonists
4.4 Die Rezeptoraktivierung durch den niedermolekularen, synthetischen Agonist E2 erfolgt unabhängig von der p10-Region
4.5 Die Aktivierungsmechanismen des hLHR und hTSHR weisen Übereinstimmungen und Unterschiede auf
4.6 Ausblick
Zusammenfassung der Arbeit
Literaturverzeichnis
Anlagen
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Publikationen
Danksagung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:74984 |
| Date | 28 May 2021 |
| Creators | Schulze, Annelie |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 10.1096/fj.202000100R |
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