Die meisten membranständigen Rezeptoren in Säugetieren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Sie sind entscheidend beteiligt an der Verarbeitung von sensorischen Reizen, an der Wirkung von Signalmolekülen, an Zellwachstum, Zellreifung und Entzündungsprozessen. Dennoch sind für viele GPCR die molekularen und auch physiologischen Funktionen nicht bekannt. Die Erforschung dieser Rezeptorproteine ist von großer medizinischer Relevanz, da deren Fehlfunktion eine mögliche Ursache für Krankheiten ist und sich GPCR häufig als pharmakologische Zielmoleküle eignen.
Mit 33 Mitgliedern bilden die Adhesion GPCR die zweitgrößte Klasse von GPCR im Menschen, die bisher allerdings am wenigsten erforscht wurde. Sie sind bedeutsam für das Immunsystem, die zelluläre Organisation während der Embryonalentwicklung, die Angiogenese und die Entstehung von Tumoren. Adhesion GPCR besitzen im Transmembranbereich die typische Struktur von GPCR, unterscheiden sich jedoch von klassischen GPCR aufgrund ihrer sehr großen und komplexen N Termini. Die Frage, ob diese Rezeptorfamilie funktionell an G-Proteine koppelt, blieb lange unbeantwortet. Für einige wenige Rezeptoren der Subfamilie wurde die Bindung von Liganden beschrieben, dennoch fehlt für diese bisher der Beweis einer Rezeptoraktivierung. Unsere Arbeitsgruppe konnte zum ersten Mal eine Gαs vermittelte Adenylylcyclase (AC) Aktivierung durch den Adhesion GPCR GPR133 zeigen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden in dieser Arbeit die Signalkopplungswege der drei Adhesion GPCR GPR126, GPR56 und CD97 mittels verschiedener in vitro Methoden untersucht, um eine G-Protein-vermittelte Kopplung zu beweisen und weiter zu spezifizieren. Eine Grundlage bildeten die erfolgreiche Entwicklung einer Klonierungsstrategie und der Nachweis einer suffizienten Expression der Adhesion GPCR sowohl intrazellulär, als auch an der Membran. Durch die N-terminale Integration eines Rhodopsin Epitops gelang eine Steigerung der Zellmembranexpression für GPR126 und GPR56. Weiterhin wurden eine funktionelle Kopplung von GPR126 und GPR56 an das Gs-Protein sowie von GPR126 an das Gi-Protein bewiesen. Da eine G-Protein-gekoppelte Signaltransduktion somit für zwei weitere Adhesion GPCR gezeigt werden konnte, kann diese als etabliert für die gesamte Rezeptorklasse gelten.:Inhaltsverzeichnis 3
Abbildungsverzeichnis 4
Tabellenverzeichnis 5
Abkürzungsverzeichnis 6
1 Einleitung 8
1.1 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und die Verarbeitung von Signalen 9
1.2 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit unbekannter Funktion 11
1.3 Die Adhesion G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 14
1.3.1 Die Struktur von Adhesion GPCR 14
1.3.2 Signaltransduktion von Adhesion GPCR 17
1.3.3 Der Adhesion GPCR GPR126 18
1.3.4 Der Adhesion GPCR GPR56 19
1.3.5 Der Adhesion GPCR CD97 20
2 Ziele und Fragestellungen 24
3 Materialien und Methoden 25
3.1 Chemikalien, Materialien, Plasmide, Primer 25
3.2 Verwendete Mikroorganismen und Zellen 26
3.3 Klonierung der Adhesion GPCR GPR126, GPR56 und CD97 26
3.3.1 Isolation von RNA 26
3.3.2 Herstellung von cDNA durch Reverse Transkription 27
3.3.3 Klonierungsstrategie und Primer-Design 27
3.3.4 Topo-Klonierung 29
3.3.5 Selektionierung der Klone 31
3.3.6 Integration von tags und pcDps-Klonierung 31
3.4 Rezeptor-Expression und Funktionsanalyse in Säugerzellen 33
3.4.1 Zellkultur und Transfektion 33
3.4.2 Oberflächen-ELISA 34
3.4.3 Sandwich-ELISA 35
3.4.4 cAMP-Akkumulationsassay 36
3.4.5 Inositolphosphat-Akkumulationsassay 38
3.4.6 G12/13-vermittelte Veränderung des Zytoskeletts 39
3.5 Statistische Auswertung der Daten 41
4 Ergebnisse 42
4.1 Zellmembranexpression von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 42
4.2 Gesamt-Zell-Expression von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 43
4.3 Aktivierung des AC/cAMP-Signalweges durch Adhesion GPCR exprimiert in COS 7-Zellen 45
4.3.1 Untersuchung der basalen GPR126-induzierten cAMP-Bildung 46
4.3.2 Untersuchung der basalen GPR56-induzierten cAMP-Bildung 48
4.3.3 Untersuchung der basalen CD97-induzierten cAMP-Bildung 50
4.4 Aktivierung des PLC/IP3-Signalweges durch Adhesion GPCR exprimiert in COS-7-Zellen 52
4.4.1 Untersuchung der basalen IP3-Bildung durch Adhesion GPCR 52
4.4.2 Untersuchung der IP3-Bildung von Adhesion GPCR mit Gαqi4-Co-Expression 54
4.4.3 Untersuchung der IP3 Bildung von Adhesion GPCR mit Gαqs4 Co-Expression 56
4.5 G12/13-vermittelte Veränderung des Zytoskeletts von Adhesion GPCR in COS-7-Zellen 58
5 Diskussion 62
5.1 Entwicklung einer erfolgreichen Klonierungsstrategie für Adhesion GPCR 62
5.2 Sicherung der Expression von Adhesion GPCR 63
5.2.1 Artifizielle Steigerung der Oberflächenexpression durch das Rho-Epitop 65
5.3 G-Protein-Kopplung der Adhesion GPCR 66
5.3.1 Der GPR126 aktiviert Gs- und Gi-Proteine 67
5.3.2 Der GPR56 aktiviert Gs-Proteine 69
5.3.3 G-Protein-Kopplung des CD97 71
5.3.4 Untersuchung einer G12/13-vermittelten Veränderung des Zytoskeletts 73
5.4 Ausblick 76
6 Zusammenfassung der Arbeit und Schlussfolgerungen 77
7 Literaturverzeichnis 79
8 Anlagen 86
Selbstständigkeitserklärung 89
Lebenslauf 90
Veröffentlichungen 91
Danksagung 92
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:13557 |
| Date | 21 September 2015 |
| Creators | Rößler, Franziska |
| Contributors | Schöneberg, Torsten, anonym, anonym, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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