Für die Aufrechterhaltung der zellulären Integrität in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist der sogenannte CWI-Weg (für „Cell Wall Integrity“) verantwortlich. Ein Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Regulation dieses Signaltransduktionsweges mit Hilfe der „real-time“-RT-PCR-Technik. Dabei konnte gezeigt werden, dass die für verschiedene Komponenten dieses Weges kodierenden Gene in ihrer Transkription weder durch Zellwandstress (ausgelöst durch Zugabe von Aculeacin) noch durch Hitzestress wesentlich beeinflusst werden. Die Wahrnehmung und Weiterleitung von Zellwandstress erfolgt in S. cerevisiae durch membranständige Sensoren, deren nähere Charakterisierung im Focus dieser Arbeit stand. Eine in der Literatur beschriebene Wechselwirkung im Hefe-Dihybrid-System zwischen den cytoplasmatischen Domänen der Sensoren Wsc1 und Mid2 mit dem GDP/GTP-Austauschfaktor (GEF) Rom2 konnte hier nicht reproduziert werden. Da auch ein bakterielles Dihybrid-System keine dieser Wechselwirkungen bestätigte, liegt die Vermutung nahe, dass hier weitere, bisher noch nicht beschriebene Komponenten, an der Signalweiterleitung beteiligt sein könnten. Auch zwischen dem cytoplasmatischen Teil von Wsc1 und dem kleinen Plasmamembran-assoziierten Protein Zeo1 konnte im Hefe-Dihybrid-System keine Wechselwirkung nachgewiesen werden. Die Deletion der Aminosäuren 295-333 innerhalb der cytoplasmatischen Domäne von Mid2 ergab, dass dieser Bereich nicht für die Sensorfunktion in vivo benötigt wird. Der Einbau eines Endozytose-Signals von Wsc1 in dieser Region führte zu einer dynamischen intrazellulären Verteilung des ansonsten statisch in der Cytoplasmamembran lokalisierten Mid2-GFP-Fusionsproteins. Der Sensor entsprach somit in seiner Verteilung eher der des Wsc1-Sensors. Allerdings konnten die Phänotypen einer wsc1-Deletion durch ein solches Konstrukt nicht supprimiert werden. Die Flexibilisierung der Stäbchenstruktur der Serin/Threonin-reichen Region von Wsc1 durch das Einfügen von 10 zusätzlichen Glycinen führte zu einem Funktionsverlust des Sensors. Bei Untersuchungen zur Funktion einzelner Domänen im Wsc1-Sensor konnten die Cysteine in der extrazellulären, Cystein-reichen Domäne (CRD) nach einer in vitro-Mutagenese als essentiell für die Sensorfunktion erkannt werden. Austausche gegen Alanine führten zu den für wsc1-Deletionen bekannten Phänotypen und reduzierten die Phosphorylierung der MAP-Kinase Mpk1 (ein Maß für die Aktivierung des CWI-Weges) auf das Niveau der wsc1-Deletion. Eine hier etablierte Methode deutet auf eine mögliche Bindung von Wsc1 an die Glucanketten der Zellwand hin, die ebenfalls durch die Cystein-reiche Domäne vermittelt werden könnte. Hier sind allerdings weiterführende Untersuchungen notwendig. Schließlich konnte durch Fusionen der Sensoren Wsc1 und Wsc2 mit GFP in der Fluoreszenzmikroskopie eine Zellzyklus-abhängige Lokalisierung der beiden Sensoren, mit einer Akkumulation am Knospenhals während der Zytokinese gezeigt werden. Durch in vitro-Mutagenese wurde nachgewiesen, dass die Internalisierung der beiden Sensoren durch Endozytose erfolgt. Wsc1 und Wsc2 nutzen dazu unterschiedliche Endozytose-Signale, die in ihrer cytoplasmatischen Domäne vorhanden sind. Eine vorläufige Zuordnung zu Kompartimenten in der Cytoplasmamembran von S. cerevisiae ergab, dass Wsc1-GFP wahrscheinlich dem RMC-C-Kompartiment zugeordnet werden kann, während Wsc2-EGFP und Mid2-EGFP eher im gleichen Kompartiment wie die Plasmamembran-ATPase Pma1 residieren (RMC-P).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-osnabrueck.de/oai:repositorium.ub.uni-osnabrueck.de:urn:nbn:de:gbv:700-201011106699 |
| Date | 10 November 2010 |
| Creators | Wilk, Sabrina |
| Contributors | Prof. Dr. Jürgen Heinisch, apl. Prof. Dr. Hans Merzendorfer |
| Source Sets | Universität Osnabrück |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/zip |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ |
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