Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / DNA is a molecule susceptible to the attack of many toxic substances. So,
studies on the toxic effects of chemical are very important. Tests that evaluate
substances genomodifier (presenting action genoprotetora or genotoxic), how the
Comet Assay, are often complex and laborious. Therefore an ultrasensitive and fast
protocol no-cell is presented for the quantification DNA triggered by chemical
compounds, called GEMO Assay (Genomodifier capacity assay). This assay includes
a prooxidant standardized (H2O2, 3M) that is used to compare the effects on dsDNA
damage of the compound-test that is evaluated with and without addition this
prooxidant. The assay is performed in black 96-well plate and use Quant-iT
PicoGreen® dsDNA Reagent and DNA from Calf Thymus. The vitamin C was used
like compound-test in different concentrations (0.1, 0.3, 1, 3 and 10 μg/mL). For
validation of GEMO Assay was used PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)
and HT29 (colon carcinoma cell line) exposed the same conditions that the proposed
test and evaluated at different tests already well described in the literature: Alkaline
Comet Assay, MTT, DCFH-DA and TBARS. The results showed high correlation with
GEMO Assay, confirming the validation. Then the test developed in this work offers
high sensitivity for detecting genomodifier substances without interference if
biological systems. / Pelo fato do DNA ser uma molécula suscetível ao ataque muitas de
substâncias, estudos sobre efeitos tóxicos ou fitoterapêuticos de compostos
químicos são necessários. Muitos ensaios que analisam o efeito genomodificador de
substâncias, às vezes, são relativamente complexos, como o Teste do Cometa.
Entende-se por ação genomodificadora aquela em que a substância testada ou
apresenta genoproteção ou genotoxicidade. Baseado na existência de ensaios in
vitro que servem como triagem para avaliar a capacidade antioxidante de um dado
composto, como o DPPH, o objetivo deste estudo foi desenvolver e validar um
método in vitro da capacidade genomodificadora de compostos químicos e
sintéticos. Assim, um ultrassensível e rápido protocolo que não utiliza sistemas
biológicos foi desenvolvido para a quantificação do DNA dupla-fita (dsDNA) exposto
a substâncias químicas, denominado de Teste GEMO (Teste de Capacidade
Genomodificadora). Esse método foi concebido para placa preta de 96 poços,
utilizando um corante altamente específico de dsDNA (PicoGreen®) e DNA
purificado de timo de bezerro (dsDNA). O teste inclui um pró-oxidante de referência,
peróxido de hidrogênio (H2O2 3M), que permite a análise comparativa dos dados
obtidos, classificando a substância testada em vários níveis de genotoxicidade e
ainda se a mesma apresenta potencial de genoproteção. Para o desenvolvimento do
teste foi utilizado um antioxidante bem conhecido pelo seu papel genoprotetor e
antitumoral, a vitamina C em diferentes concentrações (0.1, 0.3, 1, 3 e 10 μg/mL).
Para a validação do Teste GEMO, foram utilizadas células mononucleares de
sangue periférico (PBMCs) e células de adenocarcinoma colorretal (HT29), expostas
as mesmas condições que o teste proposto e submetidas a diferentes testes já bem
descritos na literatura: Teste do Cometa Alcalino, MTT, DCFH-DA e TBARS. Os
resultados mostraram alta correlação com Teste GEMO, confirmando a validação.
Portanto, o ensaio desenvolvido nesse trabalho oferece alta sensibilidade para
detectar compostos genomodificadores, sem a interferência de sistemas biológicos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/11217 |
| Date | 16 July 2013 |
| Creators | Cadoná, Francine Carla |
| Contributors | Cruz, Ivana Beatrice Mânica da, Moresco, Rafael Noal, Krewer, Cristina da Costa |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica, UFSM, BR, Bioquímica |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 200800000002, 400, 500, 300, 500, 300, 0b5fcfe0-b017-4163-80e2-17c110fbcf01, e78a16a4-0121-4293-a8d4-133be05ef24c, 05b536c5-19fb-4cae-9d69-46730a16ed09, b9fde187-b2b7-47f1-8026-ad2234c45c00 |
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