Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / hans, and is secreted into the bloodstream. It plays and important role in regulating the
metabolic activities of the body, particularly the homeostasis of the blood glucose. Insulin
glargine is a recombinant human insulin analogue produced by DNA technology using a
strain of Escherichia coli and the insulin glargine differ only by three amino acids from
human insulin. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid
chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of insulin
glargine in biopharmaceutical formulations. A RP-LC method was carried out on a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 30 ºC. The mobile phase A consisted of 0.05
M sodium sulphate buffer, pH 2.5, and the mobile phase B was acetonitrile. The SE-LC
method was carried out on a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.),
maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of 0.03 M MES acid buffer, pH 2.5, run
isocratically at a flow rate of 0.6 mL/min. Chromatographic separation was obtained with
retention times of 7.5 min, and 9.9 min, and was linear over the concentration range of 0.05 -
200 μg/mL (R2 = 0.9998) and 0.02 - 180 μg/mL (R2 = 0.9999), respectively, for RP-LC and
SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 214 nm and 200 nm for RP-LC and SE-LC
methods, respectively. The limits of detection and quantitation were 0.018 and 0.054 μg/mL,
respectively, for the RP-LC and 0.009 and 0.027 μg/mL, for the SE-LC. Specificity was
established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the
excipients. Equally, the accuracy was 100.13% and 99.38%, with bias lower than 0.85% and
than 0.86%. The validated methods were applied for the determination of insulin glargine and
related proteins and high molecular mass, in biotechnology-derived products, giving lower
mean differences of the estimated content/potencies of 0.21% and 0.16% for the RP-LC and
SE-LC related, compared to the in vitro cell culture assay. It is concluded that represents a
contribution to establish alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure
therapeutic efficacy of the biotechnology-derived medicine. / A insulina humana é um hormônio secretado pelas células β, das ilhotas de
Langerhans, e regula os níveis sanguíneos de glicose. A insulina glargina é produzida pela
tecnologia do DNA recombinante, expressa em Escherichia coli, e difere da insulina humana
pela modificação da aspargina na posição 21 da cadeia A por uma glicina, além da adição de
dois resíduos de arginina C-terminais na cadeia B. No presente trabalho foram desenvolvidos
e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão
molecular (CL-EM) para a avaliação de insulina glargina em formulações biofarmacêuticas.
No método por CL-FR, foi utilizada coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 30
ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,05 M, pH 2,5, e a fase móvel
B por acetonitrila, eluídas com fluxo constante de 0,5 mL/min. No método por CL-EM foi
utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25 ºC. A fase móvel
foi constituída de tampão MES 0,03 M, pH 2,5, eluída em vazão isocrática de 0,6 mL/min.
Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) com detecções em
214 nm e 200 nm para CL-FR e CL-EM, respectivamente. A separação cromatográfica foi
obtida nos tempos de 7,5 e 9,9 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,05 - 200
μg/mL (R2 = 0,9998) e 0,02 - 180 μg/mL (R2 = 0,9999), respectivamente, para os métodos
por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 0,018 e 0,054 μg/mL,
respectivamente, para o método por CL-FR e 0,009 e 0,027 μg/mL por CL-EM. A
especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não
houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,13 e 99,38%, com bias inferior a 0,85
e 0,86%, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os métodos propostos
foram aplicados para avaliação da potência de insulina glargina, de proteínas relacionadas
agregados de alta massa molecular em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram
comparados com o bioensaio por cultura de células in vitro, observando-se diferenças das
médias de teor/potência 0,21% e 0,16% inferiores para os métodos por CL-FR e CL-EM.
Concluí-se que representa contribuição para estabelecer procedimentos para monitorar a
estabilidade, o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do
produto biotecnológico.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/6037 |
| Date | 30 March 2016 |
| Creators | Schramm, Vanessa Grigoletto |
| Contributors | Dalmora, Sergio Luiz, Macedo, Rui Oliveira, Codevilla, Cristiane Franco |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, UFSM, BR, Farmacologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 201000000000, 400, 500, 300, 300, 500, c5c3d2e7-af0f-4f36-b006-046daf37340a, 8c62ebba-e8b5-4dc8-a4a0-867b7976f2a3, e07fc67c-96bd-43bd-b296-2f633f2a7b9b, bc9cd8f5-e992-432f-b644-bc35b05757e2 |
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