Hedgehog-signalling in malignant gliomas
The Hedgehog signalling pathway is important for the development of the central nervous system. On the other hand, aberrant induction is observed in different tumors. Immunofluorescence and real-time qRT-PCR confirmed that in some gliomas, specifically in Glioblastoma multiforme (GBM), Gli1, a transcription factor activated by signalling, is present. In general, the hedgehog pathway is initiated by binding of extracellular ligands to the transmembrane receptor Patched and leads finally to the activation of the transcription factors Gli1, Gli2, Gli3 and Gli4. Whereas Gli1 acts as an activator, Gli2 appears to be an activator but retains some repressor activities and Gli3 and Gli4 are believed to act only as inhibitors. Therefore, the determination of hedgehog activity at the level of transcription requires additional experiments measuring gene activation.
For that reason, cells isolated from 13 tumors of patients with glioblastoma (WHO Grade IV) and cells from two different glioma cell lines were transfected with reporter genes. These reporter genes carried the luciferase gene from Gaussia princeps under the control of two promoters (pT109 and pT81) conjugated to Gli binding sites. The activity of the reporter genes was compared to a control plasmid with mutant Gli-binding sites. In addition reporter gene activity was analysed in the absence and presence of the hedgehog signalling inhibitor cyclopamine and the effect of cyclopamine on cellular metabolism was studied.
The analysis revealed that the two cell lines and cells from 6 glioblastomas exhibited enhanced reporter gene activity compared to the activity mutant control. This points towards an enhanced expression of Gli1. In three cultures a repression was detected suggesting that Gli3 may be active in these cells. Four cultures did neither show activation nor repression. This could provide evidence that Gli1 and Gli3 effects cancel each other out or that there is no effect at all. Enhanced luciferase activity in cells from the line T98G and in cells from four primary cultures was not influenced by the hedgehog inhibitor cyclopamine, whereas one cell line significantly responded to its presence with a decreased activity. Interestingly, ATP level was suppressed by cyclopamine in cells from the line T98G and also in cells from one primary culture that responded to the inhibitor. This may point towards an effect of cyclopamine independent of smo.
Since cyclopamine is a potential new substance for the treatment of tumors, the observed effect of this inhibitor even in cells without an indication of hedgehog signalling activity should be investigated in further experiments in more detail. / Der Hedgehog (Hh) -Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle, so auch bei der Entstehung des zentralen Nervensystems (Varjosalo & Taipale 2008). Andererseits führt seine unregulierte Aktivität zur Ausbildung verschiedenster Tumore (Bailey et al. 2009; Fiaschi et al. 2009; Shaw et al. 2009; Velcheti & Govindan 2007). Vorausgegangene Studien wiesen durch Immunfluoreszenz und real-time qRT-PCR nach, dass auch in Gliomen, speziell in Glioblastoma multiforme, dem agressivsten Hirntumor des Menschen, Effektoren des Signalweges (Gli1) überexprimiert werden (Wang et al. 2010). Die Aktivierung des Signalweges geschieht über Bindung des Hh-Liganden an den Rezeptor Ptch und endet mit der Aktiverung der Transkriptionsfaktoren der Gli Familie (Kinzler & Vogelstein 1990; Stone et al. 1996). Die aktuell bekannten Vertreter dieser Familie sind der Aktivator der Transkription Gli1, Gli2, der als Aktivator und Repressor agieren kann sowie Gli3 und Gli4, die die Transkription inhibieren (Marine et al. 1997; Ruppert et al. 1988). Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, inwieweit die Transkriptionsfaktoren der Gli-Familie in Zellen von Glioblastoma multiforme aktiv sind.
Dafür wurden Zellen aus Tumormaterial isoliert und daraus Primärkulturen hergestellt. In diese 13 Primärkulturen, wie auch in zwei Gliom-Zelllinien, wurden mittels transienter Transfektion Reporterplasmide eingebracht. Diese enthielten ein Gen der Gaussia-Luciferase, das unter der Kontrolle zweier verschiedener Promotoren (pT109 und pT81) mit Bindungsmotiven für die Transkriptionsfaktoren der Gli-Familie stand. Weiterhin wurde der Einfluss des Inhibitors des Hh-Signalweges Cyclopamin auf die Gli-Aktivität und die Metabolische Aktivität der Zellen untersucht.
Die Beobachtungen ergaben, dass die zwei Zelllinien und sechs der primären Kulturen eine erhöhte Luciferaseaktivität und damit gesteigerte Aktivität von Gli1 zeigten. Weiterhin wiesen vier Kulturen eine verminderte Luciferaseaktivität auf. Dies ließ darauf schließen, dass in diesen Zellen Gli3 aktiv war. In den restlichen vier Kulturen zeigte sich keine Veränderung der Luciferaseaktiviät, was für einen Aufhebungseffekt von Gli1 und Gli3 oder gar keinen Effekt spricht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Luciferaseaktivität und damit die Aktivität von Gli1 in Zellen der Zelllinie T98G und von vier Primärkulturen nicht durch Cyclopamin beeinflusst wird. Lediglich eine Probe der Primärkulturen reagierte mit einer Abnahme der Luciferaseaktivität. Außerdem konnte Cyclopamin die ATP-Produktion sowohl in Zellen von T98G als auch in Zellen der Zelllinie, deren Gli-Aktivität durch Cyclopamin vermindert wurde, senken. Dies sprach für eine Smo unabhängige Wirkung des Cyclopamins. Da Cyclopamin ein potenzielles Pharmakon für die Antitumortherapie ist, bedarf dieser Umstand näherer Untersuchungen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:11806 |
| Date | 06 October 2011 |
| Creators | Braun, Stefanie Anett |
| Contributors | Gaunitz, Frank, Meixensberger, Jürgen, Bechmann, Ingo, Schaefer, Michael, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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