Les glicogen i midó sintases són glicosiltransferases que catalitzen la transferència de residus glucosil a l'extrem no reductor d'una cadena creixent d'un glucà α-1,4, retenint la configuració del carboni anomèric del sucre transferit. Aquest procès és central en el metabolisme energètic de la majoria d'èssers vius.En aquest treball presentem l'estructura cristal·logràfica de la glicogen sintasa de Pyrococcus abyssi (PaGS). Aquest enzim és termoestable i presenta una activitat màxima a 80ºC i és capaç d'utilitzar indistintament ADPG i UDPG com a donadors de glucosil. La PaGS forma de cossos d'inclusió en totes les condicions d'expressió en E.coli assajades. Amb el mètode de renaturalització en columna hem aconseguit que la PaGS es replegui correctament i ens ha permès obtenir la quantitat de proteïna pura necessària per encetar estudis de cristal·lització i de caracterització en solució.D'altra banda, el domini C-terminal de la PaGS s'expressa de forma soluble i la seva purificació ens ha permès disposar de quantitat suficient de proteïna per a realitzar estudis de cristal·lització. Aquest domini és monomèric tant en solució com en el cristall. La resolució de l'estructura del domini C-terminal a 1.7 Å a partir de reemplaçament molecular utilitzant el domini homòleg de la GS d'Agrobacterium tumefaciens (AtGS) ha permès utilitzar-lo com a model inicial per a resoldre l'estructura de la PaGS a 2.8 Å.La PaGS és un trímer tant en solució com en el cristall, amb una disposició triangular plana. Cadascuna de les seves subunitats està formada per dos dominis αβα tipus plegament de Rossmann separats per un solc molt profund on es troba el centre catalític de l'enzim. L'estructura global és molt similar a la de la resta d'estructures resoltes del grup GT-B que actuen amb retenció de la configuració anomèrica. La trimerització de la PaGS implica exclusivament els dominis N-terminals de l'enzim, quedant els dominis C-terminals lliures per a poder realitzar la transició d'obertura i tancament necessària per a la catàlisi.El domini C-teminal conté la cavitat d'unió a nucleòtid, mentre que la majoria d'interaccions amb l'oligosacàrid acceptor es produeixen a través de residus del domini N-terminal. L'elevada similitud del centre actiu entre les GS i les GP suggereix que ambdues operen a través d'un mecanisme catalític similar, si be no idèntic.L'estructura de la PaGS i la seva comparació amb l'estructura de l'AtGS ofereixen les bases per a entendre l'especificitat de les GS eucariotes per UDPG, com a substrat donador de glucosil, i la promiscuïtat de les GS d'arqueons per unir tant UDPG com ADPG.La localització d'una molècula de glucosa en la superfície de la PaGS i la comparació amb les GP eucariotes permeten suggerir un possible lloc d'emmagatzematge del glicogen en les GS.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/979 |
| Date | 20 July 2005 |
| Creators | Horcajada Garro, Cristina |
| Contributors | Guinovart, Joan J. (Joan Josep), 1947-, Ferrer Artigas, Joan Carles, Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia) |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0026 seconds