Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-10-16T19:31:17Z
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Previous issue date: 2007 / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a
paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América
Latina. A adesão e a invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e
disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície
para se ligar a componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma
proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de gel de eletroforese bidimensional de
proteínas totais do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 36 kDa e
pI 6.8 e mostraram homologia com gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH: EC
1.2.1.12) de diversos organismos. O cDNA completo e o gene que codificam para
PbGAPDH foram obtidos e ambos contém uma ORF que codifica para uma proteína com
338 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbGAPDH nativa. O
gene Pbgapdh contém 5 exons interrompidos por 4 introns. Análises realizadas com a
PbGAPDH deduzida sugerem sua utilidade em prover relações filogenéticas, como também
evidenciaram a correlação entre a filogenia e as posições dos introns nos genes cognatos. A
expressão de Pbgapdh foi analisada e uma única espécie de mRNA de 2.0 Kb,
preferencialmente expressa na fase leveduriforme de P. brasiliensis foi detectada em
concordância com os altos níveis de expressão da proteína. A proteína recombinante
GAPDH foi utilizada para produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia
imunoeletrônica e análises por Western blot, foi detectada a presença da GAPDH, na
parede celular de leveduras de P. brasiliensis e no citoplasma. A GAPDH recombinante foi
capaz de se ligar a fibronectina, laminina e colágeno do tipo I. Uma observação importante,
é que tanto o tratamento de P. brasiliensis com anticorpo anti-GAPDH, quanto de
pneumócitos tratados com a GAPDH recombinante, promoveram a inibição da aderência e
internalização de P. brasiliensis à células cultivadas in vitro (pneumócitos). Essas
observações indicam que a GAPDH possivelmente contribui para a adesão do
microrganismo aos tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis, an important human pathogen causing
paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin
America. Adhesion to and invasion of host cells are essential steps involved in the infection
and dissemination of pathogens. Furthermore, pathogens use their surface molecules to
bind to host extracellular matrix components to establish infection. An adhesin of P.
brasiliensis was isolated from gel after two dimensional electrophoresis and characterized.
Endoproteinase Lys-C-digest peptides of the purified protein, which presented a molecular
mass of 36 kDa and pI 6.8, were subjected to sequence analysis of their amino acids, that
revealed strong homology to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH: EC
1.2.1.12) from several sources. The complete cDNA and gene encoding PbGAPDH were
obtained and both contained an open reading frame predicted to encode a 338 amino acid
protein that presented all the peptides characterized in the native PbGAPDH. The Pbgapdh
gene contained 5 exons interrupted by 4 introns. Analysis performed with the deduced
PbGAPDH suggested its usefulness in providing phylogenetic relatedness, as well as
evidenced the correlation between the phylogeny provided by the deduced proteins and
introns positions in the cognate genes. The expression of Pbgapdh was analyzed and a
single species of mRNA, of 2.0 Kb, preferentially expressed in the yeast parasitic phase of
P. brasiliensis, was detected in agreement to the high levels of the GAPDH expression in
the yeast cells of P. brasiliensis. The purified recombinant GAPDH was used to produce
policlonal antibody in rabbit. By immunoelectron microscopy and Western blot analysis,
GAPDH was detected in the cell wall and the cytoplasm of the yeast phase of P.
brasiliensis. The recombinant GAPDH was found to bind to fibronectin, laminin, and type I
collagen in ligand far-Western blot assays. Of special note, the treatment of P. brasiliensis
yeast cells with anti-GAPDH polyclonal antibody and the incubation of pneumocytes with
the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of P.
brasiliensis to those in vitro cultured cells. These observations indicate that GAPDH could
be contribute to the adhesion of the microorganism to host tissues and to the dissemination
of infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/2016 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Barbosa, Mônica Santiago |
| Contributors | Soares, Célia Maria de Almeida |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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