As formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi expressam as Tc-85, glicoproteínas de superficie. A Tc85-11, um dos membros da família da Tc-85, foi caracterizado como uma proteína de adesão, com os sítios de ligação a laminina e citoqueratina 18 localizados, respectivamente, nos domínios amino e carboxiterminal. Utilizando-se primers consensos, um produto de cerca de 2000 pb foi amplificado do cDNA de formas tripomastigotas de T cruzi da cepa Y. Uma biblioteca enriquecida em membros da família da Tc-85 foi construída utilizando-se esses primers e o plasmídeo pCR T7/NT Topo Cloning (Invitrogen). O sequenciamento de cerca de 60 clones resultou em 30 ORFs completas. O sequenciamento de DNA foi realizado com o método dideoxi de terminação de cadeia e as seqüências foram analisadas. Por análise comparativa, identidades de 40-90% entres os clones sequenciados e 30-70% com membros da superfamília de proteínas das gp85/trans-sialidases foram encontradas. Os dados foram compilados nas seguintes ferramentas: ORF finder (NCBI), Cap3, Smith-Waterman, ClustalW, BioEdit e BLASTX/BLASTN (NCBI). Para a análise filogenética, foi utilizado o programa Paup empregando máxima parsimônia (MP), \"neighbor joining\" (NJ) e máxima probabilidade (MP). A árvore possuia dois grupos e foi submetida a análise de bootstrapping, com busca heurística completa e com 100 e 500 repetições. Os mesmos dois grupos apareceram quando a comparação de seqüências e análise filogenética foram correlacionadas. Em experimentos utilizando-se elementos de matriz extracelular - laminina e fibronectina- foi testada a ligação de proteínas recombinantes purificadas. A proteína codificada pelo inserto de cDNA Tc85-45 foi capaz de se ligar de maneira saturável a laminina e a fibronectina, mas não a albumina e gelatina. Os dados sugerem fortemente que, apesar da família da Tc-85- e por conseqüência a superfamília das gp85/trans-sialidases- codificarem proteínas com graus variáveis de seqüências similares, as seqüências específicas de peptídeos para a ligação a diferentes moléculas de matriz e receptores celulares variam entre membros da família, constituindo, assim, uma família multiadesiva de glicoproteínas que capacita o parasita a ultrapassar as barreiras impostas pelas membranas celulares, matrizes extracelulares e lâminas basais. / Trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi express Tc-85 surface glycoproteins. Tc85-11, one member of the Tc-85 family, was characterized as an adhesion protein, with laminin and cytokeratin-18 binding sites localized, respectively, on the amino and carboxy terminal domains. Using consensus primers, a 2000 bp product was amplified from cDNA of trypomastigote forms of T. cruzi of the Y strain. A library enriched in Tc-85 cDNA was constructed using these primers and pCR T7/NT Topo Cloning (Invitrogen) plasmid. Sequencing of about 60 clones gave 30 complete ORFs. DNA sequencing was performed by the dideoxi-chain termination method and the sequences have been analyzed. By comparative analysis, identity of 40-90% was found among the sequenced clones and 30-70%, with members of the gp85/trans-sialidase superfamily proteins. The data were compiled in the following tools: ORF finder (NCBI), Cap3, Smith-Waterman algorithm, ClustalW, BioEdit and BLASTX/BLASTN (NCBI). For phylogenetic analysis, the Paup program was employed using maximum parsimony (MP), neighbor joining (NJ), and maximum likelihood (ML). The inferred tree had two groups and was submitted to full heuristic bootstrapping with 100 and 500 repetitions. The same two groups appeared when comparative sequence and phylogenetic analyses were correlated. In experiments in which extracellular matrix elements - laminin and fibronectin- were tested for binding to purified recombinant proteins, the protein coded by the cDNA insert Tc85-45 was able to bind in a saturable manner to laminin and fibronectin, but not to albumin and gelatin. The data strongly suggest that although the Tc-85 family, and by extension the gp85/glycoprotein superfamily, encode glycoproteins with variable degrees of similar sequences, the peptide sequences specific for the binding to different matrix molecules and cell receptors varies among the family members, thus, constituting a multi-adhesion family of glycoproteins that enables the parasite to overcome the barriers imposed by cell membranes, extracellular matrices and basal laminae.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11112014-130658 |
| Date | 28 September 2004 |
| Creators | Oliveira, Débora Rose de |
| Contributors | Alves, Maria Julia Manso |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
Page generated in 0.0022 seconds