Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:46:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2013 / As paredes celulares das plantas contém uma complexa mistura de polissacarídeos e proteínas, demandando uma série de enzimas para degradá-las. Organismos capazes de secretar enzimas de degradação podem aproveitar as paredes celulares como fonte de nutrientes, agindo como verdadeiros patógenos vegetais, gerando perdas nas produções agrícolas e consequentemente à economia. A busca por novas técnicas de controle de pragas tem impulsionado estudos baseados na sua biologia, visando diminuir o uso de substâncias químicas, sabidamente prejudiciais ao meio ambiente e aos consumidores. Trabalhos anteriores detectaram sequências gênicas supostamente codificadoras de poligalacturonases em larvas de C. maculatus, besouro praga do feijão caupi. Estas enzimas degradam o ácido poligalacturônico (PGA) presente na matriz de pectina na parede celular vegetal. A partir destes dados, investigamos se os genes estavam sendo expressos e se as enzimas tinham atividade funcional no animal. Amostras de homogeneizados intestinais do inseto foram ensaiadas contra PGA em teste de difusão radial, onde a atividade detectada foi proporcional à quantidade de amostra aplicada, demonstrando que a enzima além de ser expressa, é também funcional. A distribuição espacial da enzima foi ensaiada através da dosagem dos açúcares redutores, cujo tampão mais adequado foi o citrato-fosfato, com atividade ótima no pH 6,5. Os resultados mostraram maior atividade nas amostras do conteúdo luminal, confirmando que a enzima é secretada no intestino do inseto, embora os valores das atividades absoluta e específica tenham se mostrado baixos. SDS-PAGE foi preparado para confirmação do número de isoformas encontradas em estudos anteriores. Apenas duas isoformas foram detectadas, com formação de bandas em diferentes faixas de pHs. Atividade da enzima pectinase também foi ensaiada através do teste de difusão radial contra pectina, apresentando atividade e proporcionalidade em relação à quantidade de amostra aplicada, constituindo um novo ponto a ser abordado na espécie quanto às enzimas celulolíticas.<br> / Abstract : Plant cell walls contain a complex mixture of proteins and
polysaccharides, requiring a number of enzymes to degrade them.
Organisms capable of secreting enzymes active on the cell wall
constituents can use it as a source of nutrients, acting as true plant
pathogens, generating losses in agricultural production and consequently
in the economy. The search for new methods of pest control has driven
studies based on their biology, aiming to reduce the use of chemicals,
known to harm the environment and consumers. In larvae of
Callosobruchus maculatus, known as cowpea beetle, gene sequences
encoding putative polygalacturonases were detected. These enzymes
degrade polygalacturonic acid (PGA) present in the matrix of pectin in
the plant cell wall. To assess if the enzymes were functional in C.
maculatus, samples containing intestinal homogenates were tested
against PGA in radial diffusion assays, where the activity detected was
proportional to the amount of sample applied. The confirmation of the
origin of the activity was performed using the same test, by using a
cowpea flour extract, as enzyme source, which was inactive. The spatial
distribution of the enzyme among the different compartments of the gut
of the insect was assayed by the DNS method, whose the most suitable
buffer among the tested, was citrate-phosphate, with maximum activity
at pH 6.5. Results showed greater activity in the samples of luminal
contents, confirming that the enzymes are secreted in the gut of the
insect, although the values of absolute and specific activities have been
shown very low. SDS-PAGE was prepared to confirm the number of
isoforms found in the transcriptome and in the proteome of C.
maculatus, however, only two isoforms were detected with bands at
different pH values. Due to the commonly presence of genes encoding
plants cell wall degrading enzymes in other members of the
Chrysomelidae family, pectinase activity was also assayed in intestinal
homogenates of larval C. maculatus. Radial diffusion assays against
pectin confirmed activity and proportionality in relation to the amount of
sample applied, constituting a new point to be addressed about the
cellulolytic enzymes in the species
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/106932 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Santana, Mychelle Carneiro |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Silva, Carlos Peres |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 66 p.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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