Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:46:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317900.pdf: 1698038 bytes, checksum: d51415443ed184773e517c0a2b8ceaf0 (MD5) Previous issue date: 2013 / As paredes celulares das plantas contém uma complexa mistura de polissacarídeos e proteínas, demandando uma série de enzimas para degradá-las. Organismos capazes de secretar enzimas de degradação podem aproveitar as paredes celulares como fonte de nutrientes, agindo como verdadeiros patógenos vegetais, gerando perdas nas produções agrícolas e consequentemente à economia. A busca por novas técnicas de controle de pragas tem impulsionado estudos baseados na sua biologia, visando diminuir o uso de substâncias químicas, sabidamente prejudiciais ao meio ambiente e aos consumidores. Trabalhos anteriores detectaram sequências gênicas supostamente codificadoras de poligalacturonases em larvas de C. maculatus, besouro praga do feijão caupi. Estas enzimas degradam o ácido poligalacturônico (PGA) presente na matriz de pectina na parede celular vegetal. A partir destes dados, investigamos se os genes estavam sendo expressos e se as enzimas tinham atividade funcional no animal. Amostras de homogeneizados intestinais do inseto foram ensaiadas contra PGA em teste de difusão radial, onde a atividade detectada foi proporcional à quantidade de amostra aplicada, demonstrando que a enzima além de ser expressa, é também funcional. A distribuição espacial da enzima foi ensaiada através da dosagem dos açúcares redutores, cujo tampão mais adequado foi o citrato-fosfato, com atividade ótima no pH 6,5. Os resultados mostraram maior atividade nas amostras do conteúdo luminal, confirmando que a enzima é secretada no intestino do inseto, embora os valores das atividades absoluta e específica tenham se mostrado baixos. SDS-PAGE foi preparado para confirmação do número de isoformas encontradas em estudos anteriores. Apenas duas isoformas foram detectadas, com formação de bandas em diferentes faixas de pHs. Atividade da enzima pectinase também foi ensaiada através do teste de difusão radial contra pectina, apresentando atividade e proporcionalidade em relação à quantidade de amostra aplicada, constituindo um novo ponto a ser abordado na espécie quanto às enzimas celulolíticas.<br> / Abstract : Plant cell walls contain a complex mixture of proteins and polysaccharides, requiring a number of enzymes to degrade them. Organisms capable of secreting enzymes active on the cell wall constituents can use it as a source of nutrients, acting as true plant pathogens, generating losses in agricultural production and consequently in the economy. The search for new methods of pest control has driven studies based on their biology, aiming to reduce the use of chemicals, known to harm the environment and consumers. In larvae of Callosobruchus maculatus, known as cowpea beetle, gene sequences encoding putative polygalacturonases were detected. These enzymes degrade polygalacturonic acid (PGA) present in the matrix of pectin in the plant cell wall. To assess if the enzymes were functional in C. maculatus, samples containing intestinal homogenates were tested against PGA in radial diffusion assays, where the activity detected was proportional to the amount of sample applied. The confirmation of the origin of the activity was performed using the same test, by using a cowpea flour extract, as enzyme source, which was inactive. The spatial distribution of the enzyme among the different compartments of the gut of the insect was assayed by the DNS method, whose the most suitable buffer among the tested, was citrate-phosphate, with maximum activity at pH 6.5. Results showed greater activity in the samples of luminal contents, confirming that the enzymes are secreted in the gut of the insect, although the values of absolute and specific activities have been shown very low. SDS-PAGE was prepared to confirm the number of isoforms found in the transcriptome and in the proteome of C. maculatus, however, only two isoforms were detected with bands at different pH values. Due to the commonly presence of genes encoding plants cell wall degrading enzymes in other members of the Chrysomelidae family, pectinase activity was also assayed in intestinal homogenates of larval C. maculatus. Radial diffusion assays against pectin confirmed activity and proportionality in relation to the amount of sample applied, constituting a new point to be addressed about the cellulolytic enzymes in the species

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2014-08-06T18:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326936.pdf: 1176389 bytes, checksum: 9bb7a6e55887bfd16e61a0b78d34325f (MD5) Previous issue date: 2014 / Abstract : This work confirmed the high toxicity of the storage protein from the seeds of the common bean Phaseolus vulgaris (phaseolin) on the larvae of the seed beetle Callosobruchus maculatus. When incorporated into the diet of the larvae at physiological concentrations (0.5 %) larval mortality of C. maculatus increased. The main factor involved seems to be the accumulation of vesicles containing phaseolin in the enterocytes leading to the impairment of vesicular traffic. The fate of the seed storage globulins from cowpea Vigna unguiculata (vicilin) and from P. vulgaris (phaseolin) was monitored by fluorescence microscopy after cryostat microtomy. By feeding bean beetle larvae with vicilin/ FITC and phaseolin/ FITC noticed a difference in the absorptive process of globulins among the tested diets. The intestinal epithelium of larvae fed phaseolin/ FITC showed higher fluorescence than larvae fed vicilin. A membrane bound protein has been isolated from the intestinal epithelium of larval C. maculatus by using an affinity column where the vicilin was covalently mobilized to sepharose. This protein has a high homology with the a-tocopherol (vitamin E precursor) transfer protein. These data suggest that the vicilin molecule binds to receptors in the microvillar membrane and subsequently it may be absorbed inside vesicles within the epithelial cells of the larval midgut. This process may be a case of receptor-mediated endocytosis. These findings suggest a new mechanism of antibiosis, involving accumulation of vicilin variants and phaseolin in the intestinal epithelium of the C. maculatus larvae and commitment of endocytic processes. This mechanism probably involves the binding of vicilin/phaseolin protein homologous to a a-tocopherol transfer protein, thereby killing the insect by the lack of absorption of important nutrients for development,such as the vitamin E.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:44:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318592.pdf: 7780213 bytes, checksum: df174715f61701c67a6b2e8d1f2520d7 (MD5) / Os animais pertencentes à subfamília Bruchinae são os principais predadores das sementes de leguminosas, destacando-se pela restrição na dieta alimentar ocorrendo especificidade ao nível de gênero ou família. O caruncho do feijão-de-corda (Callosobruchus maculatus) é o maior predador de sementes de Vigna unguiculata (feijão-de-corda) tanto no campo quanto de grãos armazenados. O feijão-de-corda apresenta em sua composição uma família de proteínas multifuncionais chamadas de vicilinas (globulina 7S), possuindo uma massa molecular de aproximadamente 190 kDa. Vicilinas variantes expressas em sementes de V. unguiculata vem sendo associadas diretamente aos efeitos tóxicos causados nas larvas dos bruchideos. Aqui relata-se o valor adaptativo envolvido na absorção das vicilinas e o mecanismo da resistência associado ao C. maculatus. O genótipo (IT81D-1053) de V. unguiculata mostrou-se resistente ao bruchideo (C. maculatus), não havendo emergência de adultos no período de 90 dias, enquanto sementes suscetíveis (fradinho) apresentaram emergência média de 36,42±0,59 dias. O destino das vicilinas foi acompanhado por microscopia de fluorescência, através de cortes por congelamento (criostato), ao alimentaram-se as larvas do bruchideo com vicilina suscetível/FITC, vicilina variante/FITC e com faseolina/FITC (Phaseolus vulgaris) notando-se diferença no processo absortivo entre as dietas testadas. O epitélio intestinal das larvas alimentadas com vicilina variante/FITC e faseolina/FITC apresentou por fluorescência maior quantidade de vicilina. Por microscopia eletrônica foi possível verificar a presença da proteína suscetível (fradinho) no interior das células do epitélio intestinal das larvas de C. maculatus. Evidenciando que as vicilinas se ligam aos receptores na membrana das microvilosidades e posteriormente, são absorvidas em forma de vesículas no interior das células epiteliais do intestino médio das larvas, sendo possivelmente, mediado por processo de endocitose. As moléculas de vicilinas nas vesículas formadas no epitélio intestinal são encaminhadas ao corpo gorduroso das larvas, onde foram isoladas por ultracentrifugação em gradiente descontínuo de sacarose. Essas foram caracterizadas parcialmente com a utilização do substrato vicilina 0,1% (m/m) juntamente com os inibidores EDTA (ácido etileno diamino tetra acético), pepstatina A, PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) e E-64 (trans-epoxisuccinil 4-guanidino butano), onde a Pespatina A e PMSF inibiram o processamento da vicilina, sugerindo há uma combinação de enzimas, possivelmente proteinases serínicas e aspárticas, atuando na hidrólise da vicilina, porém não foi possível identificar qual classe mecanística é responsável pelo início do processo <br> / Abstract: The animals of the Bruchinae subfamily are the main predators of legume seeds, which are distinguished by the food diet restriction, occurring specificity on genus or family level. The cowpea beetle (Callosobruchus maculatus) is the main predator of the Vigna unguiculata seeds (cowpea) in the field and stored grains. These beans present in their composition a family of multifunctional proteins called vicilins (7S globulin), with around 190 kDa as molecular weight. Variant vicilins expressed in the seeds of V. unguiculata have been directly associated to the toxic effects caused in bruchid larvae. Here we report the adaptive value involved in the uptake of vicilin and resistance mechanisms associated with C. maculatus. The genotype (IT81D-1053) of V. unguiculata was resistant to bruchid (C. maculatus) without adult emergence in a period of 90 days, while susceptible seeds (fradinho) presented emergency of 36.42 ± 0.59 days on average. The fate of vicilin was followed by fluorescence microscopy, cutting the gel (cryostate), where bruchid the larvae are fed with vicilin susceptible/FITC, vicilin variant/FITC and phaseolin/FITC (from Phaseolus vulgaris) noticing the difference in the absorptive process. The intestinal epithelium of larvae fed on vicilin variant / FITC and phaseolin / FITC fluorescence showed a greater amount of vicilin. By using electron microscopy, it was possible to verify the presence of the susceptible vicilin (fradinho) in the cells of the intestinal epithelium of larval C. maculatus. Vicilins seem to bind to receptors in the membrane of the microvilli and subsequently are absorbed in the form of vesicles inside the cells of the epithelium of the gut of the larvae, and optionally mediated endocytosis. The vicilin molecules present in the vesicles formed in the intestinal epithelium are transferred to the fat body larvae, where they could be isolated by discontinuous sucrose gradient after ultracentrifugation. They were partially characterized using 0.1% (w / w) vicilin as the substrate in the presence or not of following inhibitors EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid), pepstatin A, PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) and E-64 (trans epoxisuccinil -4 guanidino-butane), wherein pepstatin A and PMSF inhibited the processing of vicilin, suggesting that it is a combination of enzymes, perhaps aspartic and serine proteinases, acting on the hydrolysis of vicilin. However, it was not possible to identify the mechanistic class which is responsible for initiating the process.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-07-25T04:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346990.pdf: 2039452 bytes, checksum: 2fe568b2e85e5513a8947e7a52ae6d8f (MD5) Previous issue date: 2017 / O transporte de proteínas através do epitélio intestinal dos insetos é ainda pouco conhecido. Há evidências de que vicilina, uma importante proteína de armazenamento de sementes do feijão-de-corda (Vigna unguiculata), é internalizada em larvas do bruquíneo Callosobruchus maculatus. Tem sido relatado que esta globulina de armazenamento interage com proteínas presentes nas membranas microvilares ao longo do trato digestivo das larvas. Na presente Tese, as vias celulares envolvidas na endocitose de vicilina em larvas do caruncho C. maculatus foram estudadas. Vicilina marcada com FITC (purificada a partir de sementes do feijão-de-corda) foi incorporada na dieta das larvas de C. maculatus na concentração fisiológica (0,5% m/m). O destino das globulinas marcadas ou não-marcadas foi monitorado por microscopia confocal, imunohistoquímica e Western blotting. A proteína microvilar de ligação à vicilina foi purificada usando cromatografia de afinidade em uma coluna de vicilina-Sepharose seguida por espectrometria de massa MALDI-TOF. A absorção de vicilinas é um caso de endocitose mediada por receptor. O receptor de vicilina foi purificado e mostrou uma elevada homologia com as proteínas da superfamília SEC14, principalmente a proteína transportadora de ?-tocoferol. Estas proteínas estão presentes no intestino das larvas nas microvilosidades das células epiteliais, associadas a vesículas de endocitose. Vesículas endocíticas e cisternas foram encontradas em toda a extensão das células epiteliais do intestino médio. O tipo de transcitose destas macromoléculas foi confirmado através da utilização de inibidores específicos da via endocítica mediada por clatrina ou via mediada por caveolina. Os inibidores filipina III, nistatina e wortmanina inibiram significativamente a endocitose de vicilina, sugerindo que a via endocítica é principalmente mediada por caveolina. Este trabalho mostrou que a transcitose de vicilina através das células do intestino médio de larvas do inseto C. maculatus é mediada por um membro da família SEC14 homóloga à proteína transportadora de ?-tocoferol. É possível sugerir que vicilina é internalizada por endocitose dependente majoritariamente por caveolina. Em relação à faseolina foi observada dificuldade de internalização pelas larvas de C. maculatus. Estas globulinas favoreceram a geração de espécies reativas de oxigênio, onde o aumento da peroxidação lipídica foi determinado pelo método TBARS e o uso de anticorpos anti malondialdeído e 4- hidroxinonenal.<br> / Abstract : The transport of proteins across the intestinal epithelium of insects is still little known. There is evidence that vicilin, a major storage protein of cowpea seeds (Vigna unguiculata), is internalized in larvae of the bruchid C. maculatus. It has been reported that this storage globulin interacts with proteins present in the microvillar membranes along the digestive tract of the larvae. In the present Thesis, the cellular routes involved in the endocytosis of vicilin in larval C. maculatus was investigated. FITC-labeled vicilin (purified from C. maculatus susceptible seeds of cowpea) were incorporated into the diet of the larvae at physiological concentration (0.5% m/m). The fate of labeled or non-labeled globulins was monitored by confocal microscopy, immunohistochemistry and western blotting. The microvillar vicilin-binding protein was purified by using affinity chromatography on a vicilin-Sepharose column followed by MALDI-TOF mass spectrometry. The absorption of vicilins is a case of receptor-mediated endocytosis. The putative vicilin receptor was purified and showed high homology with proteins from the SEC14 superfamily. These proteins are present in the luminal surface of the midgut cell microvilli and inside these epithelial cells, associated to endocytic vesicles. Endocytic vesicles and cisternae were found throughout the extent of midgut epithelial cells. The type of transcytosis of these macromolecules was confirmed through the use of specific inhibitors of clathrin or caveolin-mediated pathways. The inhibitors filipin III, nystatin and wortmannin significantly inhibited the endocytosis of vicilin, suggesting that the endocytic pathway is mediate mainly by caveolin. In this Thesis it was shown that the transcytosis of vicilin through the midgut cells of larval C. maculatus is mediated by a member of the SEC14 family homologous to the a-tocopherol transfer protein. It is possible to suggest that vicilin is internalized by endocytosis dependent on caveolin. In relation to the phaseolin, it was observed difficulty of internalization by the larvae of C. maculatus. These globulins favor the generation of reactive oxygen species, where the increase of lipid peroxidation was determined by the TBARS method and the use of anti-malondialdehyde and 4-hydroxynenal antibodies.