La creciente demanda de información genética en campos cada vez más variados ha llevado al desarrollo de nuevas metodologías de análisis de DNA. El Proyecto Genoma Humano ha contribuido en favorecer la creación de metodologías analíticas que den información genética de manera rápida y fiable para poder culminarlo. Además, los resultados derivados del PGH han generado nuevos mercados para la genética, abriendo las puertas a nuevas posibilidades analíticas. Para continuar con estos avances, los dispositivos de análisis futuros deben reunir ciertas características tales como alta eficacia, rapidez, simplicidad y bajo coste. En la presente tesis se ha planteado como objetivo la construcción de genosensores robustos y económicos y cuya utilización no requiera supervisión profesional. Por este motivo, los transductores electroquímicos fueron nuestros candidatos de estudio por sobre otras transducciones como la óptica. Nuestros esfuerzos se dirigieron hacia la inmovilización por adsorción física del DNA debido a que es compatible con el desarrollo de dispositivos de fabricación masiva y de bajo coste. Así, se han estudiado y caracterizado distintos transductores y el que mostró propiedades físicas y electroquímicas extraordinarias fue el composite grafito-epoxi.En una primera instancia nos planteamos la construcción de genosensores amperométricos de membranas recambiables en las que el DNA se inmovilice sobre el nylon, que es el soporte más utilizado en los métodos de análisis clásicos de DNA. Los protocolos de inmovilización, hibridación y marcación enzimática sobre este soporte son muy conocidos y utilizados de manera masiva. Por primera vez una membrana de nylon modificada con DNA se integró al transductor grafito-epoxi para la detección del evento de hibridación. Vale la pena destacar además que debido a las falencias en las metodologías de detección del DNA en genosensores electroquímicos, se utilizó por primera vez un sistema de marcación basado en la enzima HRP, acoplada al DNA mediante la interacción biotina-estreptavidina, hasta ahora no utilizado en genosensores electroquímicos.Los resultados obtenidos se compararon con genosensores en los cuales el DNA se inmovilizó por adsorción física sobre un composite grafito-epoxi. Estos genosensores mostraron unas propiedades excelentes en comparación con los genosensores de membranas recambiables. Las señales amperométricas fueron sensiblemente superiores, el tiempo de hibridación se consiguió reducir desde 15 horas a 45 minutos, se pudieron detectar de 10 a 100 veces menos cantidad de analito, y la adsorción inespecífica fue notablemente inferior.Finalmente, el genosensor basado en un composite grafito-epoxi se ha aplicado también a diversos formatos. El formato de captura es el más idóneo para ser implementado en forma de kit, ya que permite tener pre-preparados los dispositivos genosensores con la sonda de captura inmovilizada. Los genosensores se podrían fabricar con procedimientos planares de fabricación masiva, lo que aumentaría sus perspectivas comerciales.Finalmente, se ha demostrado la utilidad de los dispositivos genosensores en la determinación de Salmonella, mediante el acoplamiento de la PCR y la detección del amplicón con el genosensor amperométrico. El procedimiento total de análisis fue de 6 a 8 hs, en contraste con los 3 a 5 días requeridos para la determinación con métodos microbiológicos clásicos. El nuevo dispositivo genosensor que se ha desarrollado, basado en un composite grafito-epoxi, cumple con todos los requerimientos que se habían planteado en los objetivos: es robusto, sensible, de bajo coste, capaz de ser miniaturizado y de ser construido en distintas configuraciones, su uso es sencillo y su respuesta es rápida, se ha demostrado su capacidad de ser utilizado para medidas de campo, y es viable su implementación en kits genosensores. Además, puede aplicarse a diversas situaciones analíticas y en campos de análisis genético tan variados como medicina, biotecnología y biología molecular y en determinaciones forenses, medioambientales y, principalmente, industriales. / The growing demand for genetic information in increasingly varied fields has generated new methodologies for DNA analysis. The Human Genome Project (HGP) has multiplied the demand for these techniques as it requires analytical methodologies that produce genetic information quickly and reliably. Furthermore, the knowledge obtained from the HGP has expanded the market which requires genetic devices, hence, generating new applications. To sustain these advancements, future analytical devices should be highly efficient, quick, simple and low-cost. The aim of the present thesis is to build robust and economical genosensors that can be used without professional supervision. For these reasons, electrochemical transducers were our obvious choice over other possibilities such as optical devices. Our efforts were directed towards the immobilisation of DNA using physical adsorption as this procedure is compatible with the development of mass-produced and low-cost devices. Several transducers were studied and characterised in the course of this work and we found that the graphite-epoxy composite showed extraordinary physical and electrochemical properties. At first we directed our efforts towards the development of amperometric genosensors with exchangeable membranes where DNA is immobilised on nylon as it is the more widely used support material in classical DNA techniques. The protocols for immobilisation, hybridisation and enzyme labelling using this support material are widely known and used. For the first time a nylon membrane modified with DNA was integrated to a graphite-epoxy transducer for the detection of the hybridisation event. It is worth noticing that a labelling system based on the HRP enzyme coupled to DNA through the biotin-streptavidin interaction was used for the first time due to the shortcomings of DNA detection methodologies using electrochemical genosensors. This setup had not been reported previously for electrochemical genosensors. The results obtained were compared to those of genosensors where DNA was immobilised using physical adsorption on a graphite-epoxy composite. The latter genosensors showed excellent properties compared to those with changeable membranes. Amperometric signals were sizeably larger, hybridisation time was reduced from 15 hours to 45 minutes, 10 to a 100 times less analyte could be detected and unspecific adsorption was noticeably lower. Finally, genosensors based on a graphite-epoxy composite was applied to several formats. The capture format is the most suitable for use in a kit form as it allows to have the genosensing devices already prepared with the immobilised capture probe. Genosensors could be built using mass-production planar procedures, raising their commercial potential. Lastly, the usefullness of genosensors was demonstrated in the detection of Salmonella using PCR coupling and the detection of the amplicon using the amperometric genosensor. The total analytical procedure took from 6 to 8 hs, in contrast to the 3 to 5 days required with classical microbiological methods. The new genosensor developed based on a graphite-epoxy composite fulfils all the requirements stated as part of the objectives of the present work. These requirements include robustness, sensitivity, low-cost, capability of miniaturisation, capability of being built in several configurations, ease of use and quickness. The devices proved to be useful in field studies and they can be used to produce genosensor kits. Additionally, they can be applied to a wide range of analytical situations and in a wide range of genetic analytical fields including medicine, biotechnology and molecular biology as well as forensic examinations, and environmental and industrial applications.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/3181 |
| Date | 14 June 2002 |
| Creators | Pividori, María Isabel |
| Contributors | Alegret, Salvador, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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