Submitted by PATRICK DA SILVA null (patrick_dasilva@ymail.com) on 2016-09-01T14:44:37Z
No. of bitstreams: 1
Dissertação Patrick da Silva.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-01T18:20:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1
silva_p_me_arafcf.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T18:20:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1
silva_p_me_arafcf.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5)
Previous issue date: 2016-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Sinalização química em bactérias patogênicas é um mecanismo empregado para interagir com o hospedeiro e sua respectiva microbiota. Através desta interação ocorre a regulação dos mecanismos de virulência. Estudando o mecanismo de sinalização química do sistema de 2-componentes QseBC em Salmonella enterica serovar Typhimurium foi aberta uma nova perspectiva para desvendar os mecanismos de patogenicidade. Dentre estes, uma nova proteína VisP (Virulence and stress-related Periplasmic protein) foi reportada. Seu papel inicial na interação com a enzima LpxO em S. Typhimurium foi anteriormente demonstrada. O antígeno-O da camada de LPS fornece proteção contra as defesas do hospedeiro e, particularmente, o comprimento de sua cadeia exerce um papel essencial. A montagem do antígeno-O possui o sistema Wzz, o qual determina o comprimento final de sua cadeia polissacarídica, e também apresenta uma distribuição tri-modal. Forma cadeias curtas (S-OAg), longas (L-OAg) e muito longas (VL-OAg) de antígeno-O. As proteínas WzzST e WzzfepE regulam, respectivamente, a síntese das cadeias L-OAg e VL-OAg. Neste estudo, os genes wzzST, wzzfepE, visP e lpxO foram mutados, via mutagênese λ Red, obtendo simples e duplos mutantes. Dados preliminares evidenciaram que há um aumento nas cadeias VL-OAg e L-OAg no mutante ΔvisP, e reciprocamente há diminuição de L-OAg em ΔlpxO. Foram feitos ensaios para avaliar a motilidade, invasão em células epiteliais e sobrevivência intracelular em macrófagos com as amostras obtidas pelos ensaios de mutagênese. Foi evidenciado uma redução de 1,2 e 1,0 ordem de magnitude nos processos de invasão e sobrevivência intracelular, respectivamente, no mutante ΔvisP em relação à amostra selvagem, conforme já descrito, e também uma redução de 70,61% na motilidade comparada com à amostra selvagem. Observou-se que a deleção dos genes wzzfepE e lpxO no mutante ΔvisP faz com que a bactéria retorne ao fenótipo da amostra selvagem nos processos de motilidade, invasão em células epiteliais e sobrevivência intracelular em macrófagos. Este efeito de complementação fenotípica não ocorre no mutante duplo ΔwzzST, apresentando os mesmos níveis do mutante simples ΔvisP, apesar deste possuir um aumento na expressão de genes envolvidos na motilidade e invasão celular comparado com o mutante ΔvisP. Aparentemente, há a atenuação destes processos patogênicos em bactérias com um alto nível de VL-OAg, levando-nos a hipotetizar que este tipo de cadeia de antígeno-O possui relevância na patogênese de S. Typhimurium. WzzfepE e LpxO apresentaram uma evidente participação nos processos de motilidade, invasão celular e sobrevivência intracelular via VisP, e possivelmente o antígeno-O de comprimento muito longo (VL-Oag) apresenta um papel de inibição nestes processos, além disso, evidenciou-se que VisP desempenha uma função relevante na montagem das cadeias de antígeno-O e na patogênese de S. Typhimurium. / Chemical signaling is a mechanism employed by several bacterial species to interact within surrounding microbiota and their host. Upon this interaction the pathogenic bacteria regulate their virulence traits. The two-component system QseBC was described on chemical signaling in Salmonella enterica serovar Typhimurium, and a novel branch of pathogenic cascade regulation was revealed. Among these mechanisms a novel protein was described, VisP (Virulence and stress related Periplasmic protein). VisP interacts with LpxO enzyme on the periplasm. The O-antigen of the LPS layer provides protection against host defenses, and particularly its chain’s length plays an essential role. The O-antigen assembly has the Wzz system, which determines the O-antigen final chain length, and also presents a tri-modal distribution. It forms short (S-OAg), long (L-OAg) and very-long (VL-OAg) O-antigen chains. The WzzST and WzzfepE proteins respectively regulate the L-OAg and VL-OAg synthesis. In this study, wzzST, wzzfepE, visP and lpxO genes were mutated via λ Red mutagenesis, obtaining single and double-mutants. Our preliminary data have shown that VisP increases VL-OAg and L-OAg, conversely LpxO diminishes L-OAg chain length. The motility, epithelial cell invasion and macrophage intracellular survival and replication were assessed with the mutants obtained. The ΔvisP presented 1,2 and 1,0 order of magnitude reduction in cell invasion and intracellular macrophage replication, respectively, comparing with WT S. Typhimurium, as described, and 70,61% less motility rate than WT. Mutating wzzfepE or lpxO genes in ΔvisP recovers the motility, epithelial cell invasion and macrophage intracellular survival and replication WT phenotypes. Nonetheless, this effect does not occur with wzzST gene deletion in ΔvisP, as this double-mutant presents the same phenotypes of ΔvisP single-mutant, although this deletion raises expression rates of motility and cell invasion related genes significantly. Apparently, these pathogenic processes are attenuated within samples with VL-Oag high levels, taking us to hypothesize that there is a correlation between this O-antigen chain length and S. Typhimurium pathogenesis. WzzfepE and LpxO presented an important role on motility, epithelial cells invasion and macrophage intracellular survival through VisP, and probably the VL-OAg inhibits these processes. Furthermore, VisP plays a relevant function on O-antigen chain assembly and pathogenesis of S. Typhimurium. / CNPq: 134434/2014-5
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unesp.br:11449/143760 |
| Date | 19 July 2016 |
| Creators | Silva, Patrick da [UNESP] |
| Contributors | Universidade Estadual Paulista (UNESP), Moreira, Cristiano Gallina [UNESP] |
| Publisher | Universidade Estadual Paulista (UNESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNESP, instname:Universidade Estadual Paulista, instacron:UNESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 600 |
Page generated in 0.0032 seconds