Die Durchseuchungsrate der Bevölkerung in Deutschland mit den humanen ß-Herpesviren liegt zwischen 40 und 90%. Nach der Primärinfektion verbleiben die ß-Herpesviren latent in den Körperzellen und haben die Fähigkeit, z.B. nach körperlichem Stress, bei Immunsuppression oder unter UV-Strahlung erneut in den lytischen Vermehrungszyklus einzutreten. Die kommerziell erhältlichen serologischen Methoden für die Diagnostik der humanen ß Herpesviren haben sich in den letzten Jahren wenig weiterentwickelt. Der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA) und der Immunfluoreszenztest (IFT) sind die Standardmethoden für die Diagnostik der humanen ß-Herpesviren. Da bei der Bestimmung des IgM-Titers Kreuzreaktionen sowie falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse auftreten können, reicht der IgM-Titer als alleinige Aussage für die Diagnose einer akuten Infektion nicht aus. Weiterhin fehlt bei einer Superinfektion mit einem anderen Stamm des gleichen Virus oder im Falle einer Reaktivierung des Virus oft die IgM-Antwort. In diesen Fällen kann nur auf Grund des IgG-Titeranstieges eine Reaktivierung bzw. Superinfektion angenommen werden. Bei fehlender Immunkompetenz bleibt der Anstieg des IgG-Titers jedoch oft aus. Serologische ELISA-IgG-Tests und IFT-IgG-Tests auf der Basis von Mischantigenen für den Nachweis von HCMV- oder HHV6-Reaktivierungen zeigen bei immunsupprimierten Patienten zurückliegende Infektionen bzw. Reaktivierungen an. Kommerzielle Western Blots für den Nachweis von IgG-Antikörpern gegen „late antigens“ der Zytomegalieviren sind verfügbar, werden aber nur in Speziallaboratorien eingesetzt. Weiterhin ist eine Differenzierung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B mit den kommerziell erhältlichen Methoden wie ELISA und IFT nicht möglich. Eine Unterscheidung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B wäre aber auf Grund der Unterschiede in der Infektionsfähigkeit, im Replikationsmuster, in der Epidemiologie und der Pathogenität wünschenswert.
Im Rahmen des BMBF-Projektes Bioresponse (Projektträger Jülich: Förderkennzahl beim BMBF: 03WKR03E) und der nachfolgenden Stipendiatenförderung durch die Jürgen-Manchot-Stiftung wurden für eine differenzierte ß-Herpesvirusdiagnostik auf Basis des Mikroblots je zehn HCMV- und HHV6-Antigene exprimiert und evaluiert. Die Mikroblottechnologie - eine an Mikrowellplatten angepasste und miniaturisierte Form der Streifentesttechnologie - ermöglicht den simultanen Nachweis von bis zu zehn Antigen-spezifischen IgG Antikörpern bei geringem Proben- und Reagenzienverbrauch. Von in der Literatur als antigen beschriebenen Strukturproteinen und Nichtstrukturproteinen der Betaherpesviren wurden Proteinbereiche mit und ohne bekannten Epitopen ausgewählt und als Fusionsproteine in BL-21 Zellen exprimiert. Jeweils zehn über die Ni-NTA-Agarose-Säule aufgereinigte virusspezifische Fusionsantigene wurden zur Herstellung der Mikroblots eingesetzt.
Der HCMV-IgG-Mikroblot und der HHV6-IgG-Mikroblot wiesen zu den kommerziell erhältlichen serologischen Testsystemen (HHV6 IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HCMV-IgG-ELISA von Dade Behring, Marburg, HCMV IgG recom Blot von Mikrogen, Neuried) vergleichbare Sensitivitäten auf. Im Vergleich zum HHV6-IgG-ELISA (Panbio, Rüsselsheim) ist der HHV6 IgG-Mikroblot die empfindlichere Nachweismethode. Die Spezifität des HHV6 IgG-Mikroblots ist mit den HHV6-Testsystemen (HHV6-IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HHV6-IgG-ELISA von Panbio, Rüsselsheim) vergleichbar. Weiterhin wies der HCMV-IgG-Mikroblot im Vergleich zum kommerziell erhältlichen HCMV-IgG-ELISA (Dade Behring, Marburg) und zum HCMV-IgG-recom Blot (Mikrogen, Neuried) eine Spezifität von 80% bzw. 83% auf.
Der Mikroblot hat sich als ein geeignetes diagnostisches Instrument erwiesen, um neben der Entwicklung des IgG-Antikörpertiters auch differenziert die Antigen-spezifischen IgG Antikörperantworten unter bestimmten Fragestellungen zu untersuchen. So ermöglicht der HHV6 IgG-Mikroblot erstmals eine serologische Unterscheidung von HHV6 A und HHV6 B monovalenten Seren und den Nachweis von HHV6 A/ B polyvalenten Seren.
Die Mikroblottechnologie wurde primär für die serologische Testung von Seren und Plasmen etabliert. Mit dem HCMV-IgG-Mikroblot wäre aber auch eine Liquordiagnostik möglich. Jedoch konnte mit dem HHV6-IgG-Mikroblot vermutlich auf Grund nicht ausreichender Sensitivität eine Einsatzmöglichkeit in der Liquordiagnostik anhand dieser Arbeit wegen zu geringer Probenzahlen nicht gezeigt werden. In einer anschließenden Studie sollte dennoch die Eignung der HHV6-Antigene für die HHV6-Liquordiagnostik mit einem größeren Umfang an Liquores geprüft werden.
Stabilitätstestungen zeigten, dass die Messergebnisse von am gleichen Tag wiederholt gemessenen Seren oder Plasmen reproduzierbar waren. An verschiedenen Tagen gemessene Seren und Plasmen wiesen jedoch unterschiedliche Messergebnisse auf. Mögliche Ursachen für die geringe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse im Mikroblot sind die unterschiedlichen Epitopdichten ein und desselben Antigens in den Mikroblots, die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sowie die nicht konstante bivalente Gleichgewichts- und Bindungskonstante der IgG-Antikörper im Mikroblot. In folgenden Studien sollte durch eine Optimierung des Proteintransfers der Antigene auf die Nitrozellulosemembran eine gleiche Epitopdichte gewährleistet werden. Gleichzeitig muss der Algorithmus der Software dahingehend verbessert werden, dass dieser trotz einer möglichen Verunreinigung der Mikroblots oder schwacher Hintergrundfärbung die Markerbande erkennt und eine Auswertung gewährleistet werden kann. Die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sollte nach Absprache mit dem Hersteller durch den Einsatz alternativer Blockreagenzien weitgehend reduziert werden. Weiterhin muss die Cutoff-Grenze so definiert werden, dass eine bestmögliche Sensitivität bei optimaler Spezifität der Mikroblotmethode ermöglicht wird. Dieser Cutoff kann sowohl durch die Anzahl der reaktiven Antigene als auch durch die Färbungsstärke der Antigen-Antikörperreaktion mit einem spezifischen Antigen definiert werden.
In einem zweiten klinisch orientierten Teil dieser Arbeit wurden mit der Mikroblottechnologie die HCMV- und HHV6-Antikörperantworten nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation (HSZT) untersucht. Die HCMV- und HHV6-Antikörperverläufe der Patienten nach HSZT wiesen keinen Zusammenhang zwischen nachgewiesener Reaktivierung und IgG-Antikörperentwicklung auf. Der Nachweis einer HCMV- bzw. HHV6-Reaktivierung bzw. -Infektion nur auf Grundlage des IgG-Antikörpertiters ist bei immunsupprimierten Patienten daher nicht möglich. Es konnte nicht nach jeder positiven HCMV- bzw. HHV6 PCR ein IgG-Antikörperanstieg beobachtet werden, was vermutlich durch die Immunsuppression der Patienten bedingt war. Weiterhin konnten HCMV- bzw. HHV6 IgG Antikörperanstiege selten zeitnah zu positiven HCMV- bzw. HHV6-PCR-Nachweisen gezeigt werden. Im Gegensatz dazu wurden bei weiteren Patienten mit HCMV- bzw. HHV6-positiven Transplantatspendern trotz negativer PCR frühe HCMV- bzw. HHV6-IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT nachgewiesen. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind wahrscheinlich durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B Gedächtniszellen sowie Plasmazellen verursacht und tragen zur frühen Immunrekonstitution des Patienten bei. Chemoradioresistente langlebige Plasmazellen können ebenfalls eine Ursache für frühe IgG Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT bei HCMV-positiven Patienten mit negativen HCMV- bzw. HHV6-Transplantatspendern oder bei Patienten mit positiven HCMV bzw. HHV6-Transplantatspendern darstellen.
Während die HCMV-IgG-Antikörperverläufe der Patienten nach der HSZT unabhängig von den positiven HCMV-PCR-Nachweisen durch mehrere HCMV-IgG-Antikörperanstiege und abfälle gekennzeichnet waren, wiesen die HHV6-IgG-Antikörperverläufe unabhängig von den positiven HHV6-PCR-Nachweisen nur einen HHV6-IgG-Antikörperanstieg auf, der von einem HHV6-Antikörperabfall gefolgt wurde. Da HHV6-Reaktivierungen mit 14-28 Tagen kurz nach der HSZT und im Gegensatz zu HCMV-Reaktivierungen nur in einem kurzen Zeitfenster nachgewiesen wurden, ist vermutlich nur für diesen begrenzten Zeitraum HHV6-Antigen als Trigger für die Antikörper produzierenden Plasmazellen verfügbar. Ob gesunde Probanden nach einer HHV6-Infektion oder HHV6-Reaktivierung eine ähnliche Antikörperkinetik wie HSZT-Patienten aufweisen, sollte in einer Folgestudie untersucht werden.
Mit der Mikroblottechnologie konnte ein Einfluss des HCMV-Serostatus vom Transplantatspender auf die HCMV-IgG-Antikörperentwicklung nach HSZT gezeigt werden. Überwiegend nur HCMV-positive Patienten mit positiven HCMV-Transplantatspendern wiesen unabhängig von der HCMV-Reaktivierung frühe IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT auf. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B-Gedächtniszellen oder Plasmazellen sowie seltener durch chemoradioresistente Plasmazellen verursacht und können zu einer frühen Immunrekonstitution beitragen.
Im Gegensatz zu der kommerziell erhältlichen ELISA-Technik kann mit dem Mikroblot neben der Antikörperkinetik auch differenziert die Entwicklung der Antigen-spezifischen IgG-Antikörperreaktionen untersucht werden. So konnte bei sieben von 22 Patienten trotz Abfall des HCMV-Antikörpertiters bzw. stabilem HCMV-Antikörpertiter eine Zunahme von einzelnen HCMV Antigen spezifischen IgG Antikörpern nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation beobachtet werden. Diese einzelen IgG-Antikörperanstiege könnten serologisch auf eine HCMV-Reaktivierung hinweisen.
Weiterhin konnte bei drei von zehn Patienten mit HCMV-negativen Transplantatspendern unabhängig vom HCMV-IgG-Antikörpertiter ein Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG Antikörpermuster ab dem 6. Monat beobachtet werden. Der Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG-Antikörpermuster verweist auf die Bildung von neuen IgG-Antikörper sezernierenden B-Lymphozyten und vermutlich auf einen Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender. Der Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender ist für den Patienten ein wichtiger Schritt für die Rekonstitution der B Lymphozyten nach HSZT. Mit dem HHV6-IgG-Mikroblot hingegen konnte ein Wechsel der Antigen-spezifischen IgG-Antikörper nicht beobachtet werden.
Eine Unterscheidung der HHV6-Subtypen auf serologischer Basis nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation wurde neu etabliert. Alle sieben mit dem HHV6-IgG-Mikroblot nachgewiesenen HHV6-IgG-Antikörperanstiege zeigten sowohl HHV6 A Antigen-spezifische, als auch HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Jedoch zeigten vier von sieben Antikörperverläufen überwiegend HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Weiterhin konnten HHV6 B Antigen-spezifische IgG Antikörper früher als HHV6 A Antigen-spezifische IgG-Antikörper nachgewiesen werden. Auf Grund dieser Beobachtungen ist zu vermuten, dass der HHV6 B-Subtyp zu einem früheren Zeitpunkt und häufiger nach der HSZT als der HHV6 A-Subtyp reaktiviert.:1. Einleitung 8
1.1 Humane Herpesviren 8
1.1.1 Die humanen Betaherpesviren 9
1.2 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren 11
1.2.1 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren mittels Virusanzucht 12
1.2.2 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren durch molekularbiologische Methoden 12
1.2.3 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren durch serologische Methoden 13
1.3 Multiparameterdiagnostik 14
1.4 B-Lymphozyten, die Produzenten der Antikörper 14
1.4.1 Bildung und Reifung von B-Lymphozyten 14
1.4.2 B-Zellaktivierung und Antikörperproduktion 15
1.4.3 Aufbau und Funktion des Immunglobulins G 16
1.5 Hämatopoetische Stammzelltransplantation 17
1.5.1 Rekonstitution der B-Lymphozyten nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation (HSZT) 18
1.5.2 HCMV und HHV6, ein pathogenes Potential nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 19
1.6 Zielstellung 21
2. Material und Methoden 22
2.1 Material 22
2.1.1 Geräte 22
2.1.2 Chemikalien und Substanzen 22
2.1.3 Medien 24
2.1.4 Zelllinie 24
2.1.5 Bakterien- und Virusstämme 24
2.1.6 Plasmide 25
2.1.7 Enzyme 25
2.1.8 DNA-Marker und Proteinmarker 25
2.1.9 Kits 25
2.1.10 Primer 26
2.2 Methoden 29
2.2.1 Expression der HCMV- und HHV6-Antigene 29
2.2.2 Evaluierung der viralen Antigene im Mikroblot 49
2.2.3 Vergleichsanalysen 50
2.3 Patientenproben 52
2.4 Statistische Methoden 52
3. Ergebnisse 53
3.1 Expression der HCMV- und HHV6-Antigene 53
3.1.1 Auswahl der Zielsequenzen 53
3.1.2 Klonierung der Zielsequenzen in den Expressionsvektor pet 28a (+) 54
3.1.3 Aufreinigung der Fusionsantigene 57
3.2 Evaluierung der Virusantigene im Mikroblot 59
3.2.1 Auswertung der Mikroblotdaten 62
3.2.2 Optimierung der Reaktionsbedingungen im Mikroblot 67
3.2.3 Plasma- und Liquordiagnostik – ein weiteres Einsatzfeld der Mikroblots 68
3.2.4 Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit der Messergebnisse im Mikroblot 77
3.2.5 Sensitivitäts- und Spezifitätstestung des HCMV-Mikroblots 82
3.2.6 Sensitivitäts- und Spezifitätstestung des HHV6-Mikroblots 85
3.2.7 Beurteilung der Testseren mit dem HHV6-IgG-Mikroblot 89
3.2.8 Untersuchungen zur serologischen Unterscheidung der HHV6-positiven Seren 93
3.3 Antikörperkinetiken nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation 97
3.3.1 Entwicklung der HCMV spezifischen IgG-Antikörperantwort nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 97
3.3.2 Entwicklung der HHV6 spezifischen IgG-Antikörperantwort nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 100
4. Diskussion 104
4.1 Probleme der heterologen Proteinexpression 104
4.2 Grenzen der Aufreinigung über die Ni-NTA-Agarose-Säule 104
4.3 Semiquantitative Auswertung der Mikroblotdaten 105
4.4 Optimierung der Farbreaktion im Mikroblot 106
4.5 Seren, Plasmen und Liquores - im Mikroblot einsetzbare Probenmaterialien 107
4.5.1 Vergleich der Reaktivität von Seren und Plasmen im Mikroblot 107
4.5.2 Liquordiagnostik – Möglichkeiten und Grenzen mit dem Mikroblot 108
4.6 Untersuchungen zur Stabilität der Mikroblots 109
4.6.1 Reproduzierbarkeit der Messergebnisse in einem Reaktionsansatz 109
4.6.2 Signifikante Unterschiede bei wiederholter Messung an verschiedenen Tagen 110
4.7 HCMV-Mikroblot - ein sensitives diagnostisches Testsystem 111
4.8 Drei verschiedene HHV6-Testsysteme – drei verschiedene HHV6-Prävalenzen 112
4.9 Der Mikroblot – eine serologische Methode zur Unterscheidung von monovalenten HHV6 A- und HHV6 B-Seren 114
4.9.1 Serologische Dominanz des HHV6 B-Subtyps 115
4.9.2 Interpretation der IgG-Antikörperreaktionen mit den homologen HHV6-Antigenpaaren 116
4.10 Unterschiedliche HCMV- bzw. HHV6-IgG-Antikörperkinetiken nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 118
4.11 Reduktion der HCMV-Reaktivierung durch HCMV-positive Transplantatspender 121
4.12 HCMV pp52-F1 Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen – möglicherweise ein Nachweis für HCMV-Reaktivierungen nach HSZT 122
4.13 Wechsel der Antigen-spezifischen IgG-Antikörpermuster 182, 204 und 283 Tage nach der HSZT 123
4.14 Differenzierung der HHV6 A-Antigen- und HHV6 B-Antigen-spezifischen Antikörperreaktionen nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 123
5. Zusammenfassung, Ausblick und Perspektiven für die Mikroblottechnologie 125
6. Literatur 129
7. Danksagung: 142
8. Thesen 144
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:25378 |
| Date | 15 June 2010 |
| Creators | Thäder-Voigt, Andrea |
| Contributors | Jacobs, Enno, Bachmann, Michael, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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