Established biopharmaceuticals such as antibodies and derivatives thereof are relatively large. In cancer therapy, this creates a steep drug concentration gradient within tumors, leaving cells far from blood vessels effectively untreated. Continuous pseudo treatments should foster the development of drug resistance and might lead to eventual disease relapse. Drug concentration gradients can be operationalized as tissue penetration efficiencies, which are functions of molecular size. However, small particles are also subject to potent renal clearance, collapsing the therapeutic window beyond clinical applications. In this master’s thesis, spatial bispecificity was engineered into a single albumin binding domain (ABD). Resulting ABD derived affinity proteins (ADAPTs) are saved from urinary excretion by the grace of HSA, but in the more static microenvironment of tumors, following HSA dissociation, they are capable of tissue penetration efficiencies bestowed only upon smaller particles. To this end, phage display was used to raise ADAPTs against the cancer associated proteins human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) and carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 (CEACAM6), but also the inflammation marker C-reactive protein (CRP). Via Sanger sequencing, 9 variants were picked for protein production and characterization, among which two spatially bispecific binders were found. ADAPTs were also evaluated for aggregation tendencies, structural conformity to library design, and thermal stability. One ADAPT, binding HER2, passed all tests of initial characterizations. Deep sequencing was used to analyze selection output, from which many more binders should be screened in future experiments. / Etablerade bioläkemedel liksom antikroppar och deras derivat är relativt stora protein. Som cancerterapeutiska skapar de således branta koncentrationsgradienter utgående från tumörpenetrerande blodkärl. Detta riskerar att lämna vissa cancerceller utanför det terapeutiska fönstret. Det svaga selektionstryck som således verkar i tumörperiferin fostrar cancerceller till att utveckla resistens mot detsamma. Koncentrationsgradienten beror på proteinets vävnadspenetrarande förmåga, vilken är en funktion av proteinets storlek. Mindre proteiner borde därmed lättare ackumuleras i hela tumören och förebygga resistensutveckling. Problemet med små proteiner är deras mycket korta halveringstid i serum, en följd av relativt obehindrad filtrering ut i urinen via njurarna. I det här examensarbetet utvecklades rumsbispecifika bindare av cancerassocierade protein med hjälp av fagdisplayselektioner från ett proteinbibliotek baserat på en enda albuminbindande domän (ABD). Resulterande ABD deriverade affinitetsprotein (ADAPT) undkommer ovan nämnda filtrering tack vare sin naturligt starka interaktion med humant serumalbumin (HSA). I den mer långsamt flödande tumörmikromiljön tillåts ADAPTerna efter albumindissociation sedan utöva en bland bioläkemedel överlägsen vävnadspenetration. Tre parallella selektionsspår utfördes mot de cancerassocierade målproteinerna human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) och carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 (CEACAM6) samt den utsöndrade inflammationsmarkören C-reaktivt protein (CRP). Via Sangersekvensering kunde flera kandidater identifieras. Bland 6 karakteriserade ADAPTer uppvisade samtliga hög HSA-affinitet, tre konstaterades interagera specifikt med sitt målprotein, och två verkade binda även rumsbispecifikt. ADAPTer utvärderades även för sin benägenhet att bilda aggregat, strukturell överensstämmelse med experimentell design, och värmestabilitet. Endast en bindare, mot HER2, klarade sig genom alla prövningar som proteinkarakteriseringen innebar utan underkänt. Även en högparallel sekvensering utav selektionsresultat utfördes, men utanför de tidsramar som tillät ytterligare karakterisering.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-278699 |
| Date | January 2020 |
| Creators | Borin, Jesper |
| Publisher | KTH, Skolan för kemi, bioteknologi och hälsa (CBH) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2020:169 |
Page generated in 0.0026 seconds